论文摘要
本研究合成并评价了4种色谱限进填料（restricted access material, RAM）。通过自制RAM C18预柱,建立了在线样品预处理HPLC柱切换系统测定人血清卡马西平和多奈哌齐的方法。利用液相色谱-串联质谱技术,建立了体内福多司坦血药浓度测定方法,并成功地应用于药物动力学研究。全文分五章。第一章介绍了体内药物分析研究进展,生物样品在线前处理技术,蛋白相容限进色谱填料的研究情况,液相色谱-串联质谱（HPLC tandem mass spectrometry, HPLC/MS/MS）技术。第二章介绍了4种RAM色谱填料的合成情况,对其反相性能、阴离子保留性能、蛋白洗脱性能、耐用性进行了评价。元素分析结果RAM C18 5μm填料C含量为12.58%,H含量为2.30%,RAM C18 10μm填料C含量为15.89%,H含量为2.82%,提示键合反应顺利。阴离子交换RAM-1填料C、H、N含量分别为7.46%,1.51%,0.75%,阴离子交换RAM-2填料C、H、N含量分别为8.39%,1.73%,1.61%,提示键合反应顺利。以卡马西平、戊巴比妥钠、巴比妥、苯巴比妥对照品溶液作为反相评价药物,对RAM C18柱的反相特性进行了评价,流动相为水-甲醇（60:40, v/v）,流速为1.0mL/min。在该条件下洗脱顺序依次为:戊巴比妥钠（0.65 min）、巴比妥（0.73min）、苯巴比妥（1.82 min）、卡马西平（4.28 min）,证实填料具有较好的反相特性。以戊巴比妥钠、氨基苯甲酸、对氨基水杨酸钠对照品溶液作为离子交换评价药物,对阴离子交换RAM-1预柱的阴离子保留特性进行了评价,流动相为水-甲醇（60:40, v/v）,流速为1.0mL/min,进样量为20μL。结果表明,在所选洗脱条件下戊巴比妥钠、氨基苯甲酸、对氨基水杨酸钠对照品溶液的保留时间均大于15 min,证实合成的两种阴离子交换RAM色谱填料对阴离子化合物具有较好的保留特性。以德国MERCK公司同类型产品LiChrospher ADS C18为参照,比较了实验合成4种规格RAM色谱填料同MERCK公司同类产品蛋白洗脱性能（限进性能）。评价结果显示实验合成的RAM C18反相色谱硅胶填料同MERCK公司同类型产品LiChrospher ADS C18色谱硅胶填料蛋白洗脱性能相类似。实验合成的阴离子交换RAM-1、阴离子交换RAM-2色谱硅胶填料亦有着较好的蛋白洗脱性能。说明所得填料的色谱行为完全符合RAM色谱柱填料的特征。RAM柱耐用性评价结果显示经过多次血清进样后,4种RAM柱柱压基本保持稳定,表明所合成的RAM填料具有较好的耐用性。第三章通过自制RAM C18色谱填料预柱,建立了在线样品预处理HPLC柱切换系统测定人血清卡马西平和多奈哌齐的方法。含卡马西平血清样品预处理采用自制RAMC18 （4.6 mm×10 mm,10μm）预柱,分析柱为Microsorb-MV C18 column （4.6 mm×150 mm,4μm ）,以水-甲醇（95:5, v/v）为血清蛋白冲洗流动相,流速2 mL/min,水-甲醇（40:60, v/v）为分析流动相,流速0.8 mL/min,柱温:室温,检测波长285 nm。切换阀切换时间为3.0 min,卡马西平的保留时间为9.2 min,分析周期为12.0 min。结果显示本方法线性范围为2.0～40.0μg/mL,r = 0.9997,LOQ为2μg/mL,日内、日间精密度RSD小于5%,方法回收率均大于95%。含多奈哌齐血清样品预处理采用自制RAMC18 （4.6 mm×10 mm,10μm）预柱,分析柱为Microsorb-MV C18 column （4.6 mm×150 mm,4μm ）,以水-乙腈（99:1, v/v）为血清蛋白冲洗流动相,流速2 mL/min,分析流动相由20 mM磷酸盐缓冲液（pH 4.6）-乙腈-三乙胺（65:35:0.1, v/v）组成,流速1 mL/min,柱温为室温,检测波长315 nm。切换阀切换时间为5.5 min,多奈哌齐的保留时间为11.5 min,分析周期为16.0 min。结果显示本方法线性范围为0.02～1μg/mL,r = 0.9995,LOQ为0.02μg/mL,日内、日间精密度RSD小于7%,回收率为87.9%～89.2%。在线样品预处理HPLC柱切换系统串联了RAM反相预柱和C18分析柱,分析时间短,显著降低了萃取及分离的时间,且回收率较高。同离线血液中药物测定方法相比,本方法显著降低了样品前处理的时间,分析条件易于实现,成本亦较低。第四章建立了HPLC/MS/MS技术定量测定血清中福多司坦血药浓度方法,并对福多司坦药代动力学参数进行了研究。质谱检测采用多反应监测模式（Multireaction moniter, MRM）,使用ESI离子源,正离子模式,主要质谱参数为源温度500 ?C,扫描间隔200 ms,离子源气流60～70 psi,气帘气流20 psi,碰撞气流5 psi,喷雾电压5500 V,去簇电压16 V,入口电压10 V,碰撞电压22 V,碰撞池出口电压14.7 V,福多司坦离子对选择质荷比为180.2/91.0。含福多司坦血清样品预处理采用蛋白沉淀法。色谱分离采用Microsorb-MV C18柱（4.6 mm×150 mm, 5μm,Varian,美国）,分离温度为30℃,流动相为20 mM甲酸-乙腈（75:25, v/v）,流速为0.40 mL/min。结果显示,血清内源性物质及其他杂质不会干扰福多司坦样品的分离测定,福多司坦的保留时间为3.60 min,分析周期为4.0 min。本方法线性范围为100～20000 ng/mL,r = 0.9998,日内、日间精密度RSD小于5%,萃取回收率方法回收率均大于80%。该方法不需进行柱前或柱后衍生化即可对血清中的福多司坦进行定量测定,简化了福多司坦的测定方法,缩短了样品处理时间且减少了变异因素的引入,为直接快速定量测定生物样本中氨基酸提供了新的方法和解决途径。第五章建立了RP-HPLC同时测定含丹参的中药制剂中隐丹参酮、丹参酮Ι、丹参酮ⅡA含量的方法。采用Microsorb-MV C18色谱柱（4.6 mm×150 mm, 5μm）,甲醇-四氢呋喃-水（25:30:45, v/v）为流动相,流速:1.0 mL/min,检测波长254 nm,柱温为室温。实验结果显示隐丹参酮在0.130μg/mL、丹参酮Ⅰ在0.530μg/mL,丹参酮ⅡA在0.530μg/mL线性关系良好,平均加样回收率分别为94.1%、100.6%和90.3% （n=5）。本实验所建立的RP-HPLC同时测定含丹参的中药制剂中隐丹参酮、丹参酮Ι、丹参酮ⅡA含量的方法简便快速,灵敏度和重复性均符合中药制剂质量控制测定的要求,为含丹参中药制剂质量标准的建立提供了参照。
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相关论文文献
- [1].多种样品前处理方法在高分辨质谱法检测农药残留中的应用[J]. 食品安全质量检测学报 2020(02)
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