论文摘要
第一部分目的：制备高纯度、酶解效率高、酶切位点专一的测序级胰蛋白酶,应用于蛋白组学研究的蛋白质鉴定与分析中。方法：取实验室自制的猪胰蛋白酶粗酶,经硼氢化钠、甲醛还原甲基化修饰抑制胰蛋白酶自水解；高效液相色谱仪15RPC反相柱纯化,收集对应的甲基化胰蛋白酶峰组分,冷冻干燥。甲基化修饰的胰蛋白酶进一步经TPCK修饰以抑制糜蛋白酶等非特异性酶酶切活性及反相色谱柱再纯化,最后获得终产物即质谱测序级胰蛋白酶。自制的测序级胰蛋白酶经SDS-PAGE胶电泳；HPLC反相色谱分析；酶比活力测定；并应用于胶内蛋白质酶切质谱鉴定氨基酸序列,溶液内酶解蛋白肽段图谱分析,LTQ质谱酶切位点特异性分析等方法检测酶的纯度,酶水解效率及酶切位点特异性。结果：自制甲基化TPCK修饰的测序级胰蛋白酶纯度大于95%,酶比活力为200Units/mgP （TAME）以上,质谱分析酶切位点特异性好,酶切完全；且蛋白酶的制备工艺流程稳定,可应用于测序级胰蛋白酶产品的工艺生产与开发。结论：本研究制备的测序级胰蛋白酶纯度高、酶解效率优、酶切特异性强,可广泛应用于实验室中蛋白质和肽段测序鉴定,HPLC肽段谱图分析等蛋白组学研究分析中。第二部分目的：建立一种简单、稳定、高效的胚胎大鼠背根神经节体外培养,神经元细胞原代培养和纯化的方法。方法：解剖镜下摘取孕15天的胚胎大鼠背根神经节,进行单个背根神经节的体外培养；或采用木瓜蛋白酶溶液消化背根神经节体,制成神经元单细胞悬液。接种于NeuroBASAL培养基中,培养24h后,加入抗有丝分裂的5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷一胞嘧啶核苷的培养基,以抑制非神经元细胞的分裂增殖,进行神经元细胞的离体纯化培养。同时应用IncuCyteTM活细胞实时成像系统观察神经元生长状况及神经轴突生长现象。培养7天时,采用钙黄绿素AM活细胞染色的方法观察背根神经节,神经元细胞的生长状态及活性；采用神经元特异性的NeuN免疫细胞化学染色及DAPI染活细胞核的方法鉴定并计算神经元细胞的纯度。结果：分离培养的背根神经节神经元细胞生长状态良好,并长出轴突,形成密集的网络,具有较好活性,可体外存活1个月以上。原代培养7天时,NeuN鉴定细胞阳性表达率高,神经元细胞纯度可达到90%。结论：本研究建立的胚胎大鼠背根神经节组织培养,高度纯化的神经元细胞体外培养方法简单、稳定、高效,可作为神经科学和药理学等相关研究的重要实验模型。
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