岩黄连细胞培养合成生物碱研究

论文摘要

植物细胞培养被认为是解决资源危机的理想途径。本论文工作旨在建立岩黄连细胞培养合成生物碱的技术方法,主要围绕岩黄连细胞培养的建立、生物碱的诱导合成和药理作用进行研究,主要研究结果如下:1.通过筛选外植体、培养基和培养条件建立了岩黄连愈伤组织和细胞悬浮培养体系。结果表明岩黄连叶片最适合诱导愈伤组织,最佳诱导培养基为B5基本培养基中添加0.5 mg/l 2,4-D和2 mg/l BA,诱导率为94%。7.5-10%（FW）的接种量对悬浮细胞培养较为合适,接种量过少会抑制细胞生长。B5和MS基本培养基均适合细胞的生长。培养基的最佳初始培养基pH值为6.0。岩黄连悬浮细胞培养的生长周期为24天,最大生物量出现在第18天。2.建立了分光光度发测定岩黄连总生物碱含量。结果表明岩黄连细胞中生物碱含量低于植株中生物碱含量。以总生物碱含量为指标,采用回流提取法和超声提取法两种方法对岩黄连细胞进行提取,优化提取工艺,发现两者之间没有显著性差异,回流提取耗时短,提取效率高于超声提取法。通过TLC、LC-MS等方法,对岩黄连细胞培养中的生物碱成分进行鉴定。发现岩黄连细胞中主要含有脱氢卡维丁和小檗碱,可能含有新的生物碱成分。建立反相高效液相色谱法同时测定脱氢卡维丁和小檗碱的含量,检测方法准确、可靠。细胞中脱氢卡维丁含量较植株中含量低,细胞中可检测到小檗碱,而植株中没有检测到小檗碱。3.对岩黄连细胞悬浮培养的生长过程和营养物质消耗进行动态研究。发现培养液的pH值在5.0-7.0之间变化。岩黄连细胞的生长曲线呈“S”型,细胞的生长与碳、氮、磷元素的消耗以及生物碱的合成相吻合。大量元素的消耗速率为PO43- > NH4+ > C > NO3-,在大量元素中无机磷消耗最快。对岩黄连细胞进行摇瓶放大培养,发现岩黄连细胞在100-ml培养体系中生长最快,生物量也最高。4.使用来自于黑曲霉细胞壁多糖成分的真菌诱导子处理岩黄连悬浮培养细胞,可提高岩黄连悬浮细胞培养中生物碱的产量。最佳诱导子浓度是50 mg/l。来源于黑曲霉细胞壁降解物的真菌诱导子可以诱发岩黄连细胞中活性氧的大量产生,提高细胞中苯丙氨酸解氨酶的活性,引起细胞死亡,提高可溶性蛋白和次生代谢产物含量。认为黑曲霉真菌诱导子处理可诱发岩黄连悬浮细胞发生防御反应,诱导子导致生物碱产量升高也是植物细胞防御反应的一种体现。对Ca2+信号和H2O2在真菌诱导子诱发岩黄连细胞防御反应中的作用进行研究,发现诱导子刺激次生代谢产物的合成是通过Ca2+信号传递并激发防御反应而产生的。诱导子诱导岩黄连细胞产生的H2O2可以导致膜脂过氧化,但诱导产生的H2O2对于生物碱的累积并没有直接贡献作用。对JA在岩黄连细胞中生物碱的诱导合成中的作用进行研究,发现真菌诱导子处理可以提高岩黄连细胞中的JA含量,来启动岩黄连悬浮培养细胞中生物碱合成。LOX抑制剂的加入没有完全抑制诱导子诱导的生物碱的累积,表明真菌诱导子除了通过十八烷醇途径激活生物碱合成外,还存在其他的信号途径导致生物碱的累积。5.通过岩黄连细胞生物碱对CCl4诱导小鼠急、慢性肝损伤模型进行治疗,发现生物碱对肝损伤有不同程度的保护作用,可降低因CCl4引起的小鼠血清ALT、AST和肝脏MDA水平的升高,并能提高SOD活性,使肝组织病理变化得以改善,其作用机理与自由基清除有关。细胞生物碱对急性肝损伤的治疗比慢性肝损伤更为有效,且优于植株生物碱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 岩黄连简介
• 1.2 岩黄连的主要药理作用
• 1.3 植物细胞培养生产次生代谢产物
• 1.4 提高次生代谢产物产量的方法
• 1.5 诱导子促进次生代谢产物合成的机制
• 1.6 本文研究内容
• 2 岩黄连愈伤组织诱导与悬浮细胞培养体系的建立
• 2.1 岩黄连愈伤组织诱导
• 2.2 岩黄连细胞悬浮培养的建立
• 2.3 本章小结
• 3 岩黄连细胞中生物碱提取分析与测定
• 3.1 分光光度法测定岩黄连总生物碱含量
• 3.2 岩黄连细胞中生物碱的提取
• 3.3 岩黄连细胞中生物碱成分分析
• 3.4 反相高效液相色谱法测定脱氢卡维丁和小檗碱含量
• 3.5 本章小结
• 4 岩黄连悬浮细胞生长与代谢动力学
• 4.1 岩黄连悬浮培养中细胞生长与代谢动力学
• 4.2 放大培养对岩黄连细胞悬浮培养的影响
• 4.3 本章小结
• 5 岩黄连细胞中生物碱的诱导合成
• 5.1 真菌诱导子促进岩黄连细胞生物碱合成
• 5.2 真菌诱导子引发岩黄连细胞的防御反应
• 2+和活性氧在岩黄连细胞防御反应中的作用'>5.3 Ca²⁺和活性氧在岩黄连细胞防御反应中的作用
• 5.4 茉莉酸在诱导岩黄连生物碱合成中的作用
• 5.5 本章小结
• 6 岩黄连生物碱对急、慢性化学性肝损伤的保护作用
• 6.1 岩黄连生物碱对小鼠急性肝损伤的保护作用
• 6.2 岩黄连生物碱对慢性肝损伤的保护作用
• 6.3 本章小结
• 7 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 展望
• 8 本文创新之处
• 致谢
• 参考文献
• 附录I 攻读学位期间发表论文目录