用抑制性差减杂交筛选Kaposi肉瘤相关基因

论文摘要

卡波氏肉瘤（Kaposi’s Sarcoma,KS）是一种缓慢进展的恶性多发色素性血管肉瘤,好发于皮肤,可累及内脏。临床上KS分为四型:经典型、艾滋病相关型、非洲地方型、免疫抑制/器官移植相关型。KS具有明显的地域和种族特点,主要见于地中海沿岸国家、犹太人后裔等。新疆是我国KS的高发区,目前国内报道的经典型KS仅见于维吾尔族和哈萨克族这两个新疆主要的少数民族。人类8型疱疹病毒（Human Herpesivirus-8,HHV-8）,被认为是KS的重要致病因素。一些学者认为细胞因子紊乱、遗传因素也与KS发生存在一定的关系,但KS确切的发病机制尚无定论。由于KS是艾滋病最常见的并发肿瘤,其发病机制研究得到广泛关注。肿瘤的发生发展与基因结构的改变和表达变化有密切关系,而关于KS差异表达基因的筛选,目前国内外尚未见报道。目的 此项研究旨在筛选KS肿瘤组织与正常皮肤组织间差异表达基因,建立KS差异基因cDNA文库,从分子水平探讨KS发病机制。方法 采集1例典型KS患者新鲜KS肿瘤组织,同时选取该患者完全正常的皮肤组织作为对照,抽提总RNA,逆转录合成双链cDNA（dscDNA）,经Rsa Ⅰ酶切后,与两种不同的接头衔接,分别以正常组织和肿瘤组织作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交（Suppression subtractive hybridization,SSH）,筛选KS肿瘤组织与正常皮肤组织间差异表达基因,将差异基因PCR扩增,与PGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,构建差异基因文库。采用蓝白斑筛选,获得白色阳性克隆菌落,煮沸破菌,PCR扩增出未知基因片段作进一步筛选。随机测序,采用Blast n、Blast x与Genebank进行同源性比较。同时利用巢式PCR技术检测该患者是否存在HHV-8感染。结果SSH分析KS肿瘤组织和正常组织的基因表达谱,得到多个位于200～500 bp的差异条带,成功构建了2个差减文库,分别代表在肿瘤组织中表达上调和下调基因。克隆、PCR鉴定,每个阳性克隆均载有单一片段,随机测序207个阳性克隆,得到差异表达基因共30条。患者存在HHV-8感染。结论 经双向抑制性差减杂交初步筛选了KS差异表达基因,获取了KS差异表达基因文库。并通过测序发现,过表达的抗原CD164可能通过粘附作用、促上皮和血管内皮细胞增殖、介导原癌基因c-myc信号转导等途径在KS的发病机制中发挥一定的作用;原癌基因c-myc可能通过点突变、过表达或HHV-8病毒感染等方式被激活,可能参与KS发生发展过程中的细胞增值、肿瘤血管增生等;热休克蛋白HSP40的表达下调可通过减弱HSP70活性的途径,影响HSP70发挥保护组织细胞、抗肿瘤、调控细胞周期、分子伴侣及参与免疫等作用;KS可能存在代谢异常和线粒体的改变;另外,还发现一些可能在KS中特异发挥作用而在其他肿瘤中未报道明确功能的基因,这些基因的作用有待于进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要符号表
• 前言
• 第一部分 用双向抑制性差减杂交筛选KS肿瘤与正常皮肤组织间的差异基因
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 KS差异基因的克隆、筛选和鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 测序生物信息学分析KS相关基因及血清HHV-8感染检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 作者简历
• 导师评语