论文摘要
聚-（?）-羟基烷酸是微生物代谢过程中产生的贮存物质，可被微生物完全降解，是一类新型高分子热塑材料，在工业、农业、医药、食品、环保行业有着广阔的应用前景。本研究利用低能氮离子注入方法对出发菌pCB4进行改良，研究了离子注入适宜的技术参数，进行了产PHA突变体的筛选和突变体遗传稳定性分析，利用PCR技术和生物信息学方法分析了突变体的分子机制，获得如下主要结果：1．采用低能氮离子注入出发菌pCB4后，呈现出一种先降后升再降的“马鞍型”剂量存活曲线。确定出发菌最适注入能量为10keV、注入剂量为7．8×1014N+/cm2。2．通过多轮诱变筛选，最终获得了一株高产菌株，并将其命名为pCBH4，对该菌株进行了进一步传代实验，结果表明该菌株在合成PHA性状上具有遗传稳定性；通过提取pCBH4突变菌株含合成PHA基因的质粒转化受体菌DH5a，证实高产PHA是由于质粒合成PHA相关基因突变所致。3．研究对所得的PHA样品进行气相色谱分析。结果表明，突变体PHA样品中组分主要为PHB，占41．33％，比对照提高了48．78％，而样品中其它成分含量则较少，这说明突变主要利于催化合成PHB。4．根据原始序列设计引物，从突变株pCBH4中扩增出了phaA、phaB和phaC基因，并对其进行了序列分析，发现突变体phaA基因在序列末端有七处碱基发生改变，导致5个氨基酸发生变化。phaC基因在序列末端有也有七处碱基发生改变，导致5个氨基酸发生改变。碱基突变以颠换为主，颠换频率为78．57％，转换频率为21．43％。突变株phaA和phaC基因碱基和氨基酸序列的变异导致DNA及蛋白质二级结构和部分性质的变化，而phaB基因的碱基序列未观测到变化。5．对突变株pCBH4的发酵条件进行了研究。选用蛋白胨作为氮源，当接种量为8％，培养基初始pH7．0，摇瓶培养24h，再静止培养36h时，能获得较大的生物量、PHA浓度和PHA含量，分别为2．26g／L，1．81g／L和80．08％，分别比对照提高了82．26％，196．72％和62．80％。