抗菌肽BhSGAMP-1-S的优化表达及其抑菌活性分析

论文摘要

从低等生物到高等动物,包括人等各种生物均产生具有抗菌和免疫调节等生物活性的小肽,统称为抗菌肽。它是生物先天免疫的重要组成部分,不仅有广谱抗细菌能力,而且对真菌、病毒、原虫、癌细胞也有一定的抑杀作用,此外还具有相对分子质量小、稳定性好、水溶性好、抗菌机理独特、具有选择毒性等特点。抗菌肽的这些特点使得有关抗菌肽及其应用成为临床医药学、动物学、食品防腐剂、饲料添加剂等领域的热点。抗菌肽BhSGAMP-1是来源迟眼蕈蚊Bradysia hygida的一种抗菌肽,它是由幼虫在准备蜕皮时由唾液腺特定表达的以帮助预防微生物侵染,具有广谱抗菌活性,但截止目前尚未有利用基因工程方法制备BhSGAMP-1的研究报道。本研究通过基因工程方法,在大肠杆菌中高效表达了经过遗传密码修饰的抗菌肽基因BhSGAMP-1-S,并对表达产物进行分离、纯化以及活性测定,以期获得BhSGAMP-1-S优化表达的条件和纯化途径,为深入研究该抗菌肽的规模化生产提供基础。参考GeneBank中收录的BhSGAMP-1 cDNA序列,利用大肠杆菌偏爱密码子置换方法重新设计基因序列,人工合成了遗传密码修改后的BhSGAMP-1-S新基因（GenBank accession no.GQ914992）。将基因片段BhSGAMP-1-S克隆到表达载体pMAL-c2X上,在TB1宿主菌中融合表达,通过改变诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间、菌体浓度,摸索出了融合蛋白MBP-BhSGAMP-1-S以可溶形式大量表达的最佳诱导条件。经SDS-PAGE电泳鉴定分析,表达产物的分子量约为50 kDa,融合蛋白的表达量可占总蛋白的52.6%。将诱导菌液超声破碎,经直链淀粉亲和层析柱纯化,纯化后的产物经过肠激酶切割,分子筛凝胶层析和反相高效液相层析,得到纯化的具有抗菌活性的重组抗菌肽BhSGAMP-1-S,分子量大小约为7.2 kDa。产率为每100 mL工程菌可获得0.38 mg重组抗菌肽。最后,采用液体抑菌法、琼脂糖凝胶扩散法等方法测定纯化抗菌肽BhSGAMP-1-S的生物活性。结果表明,BhSGAMP-1-S对测试的部分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、植物致病性真菌有明显的抑制作用。本研究构建了遗传密码优化的BhSGAMP-1-S基因高效表达的工程菌,并获得高纯度的重组抗菌肽BhSGAMP-1-S,探索了一种纯化具有生物活性的重组抗菌肽的简便方法,为进一步研究和利用该抗菌肽奠定了物质基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 抗菌肽的研究进展
• 1.1.1 抗菌肽的发现
• 1.1.2 抗菌肽的分类
• 1.1.3 抗菌肽的生物活性
• 1.1.4 抗菌肽作用机制
• 1.2 抗菌肽基因工程进展
• 1.2.1 大肠杆菌表达系统
• 1.2.2 酵母表达系统
• 1.2.3 杆状病毒表达系统
• 1.2.4 转基因动、植物表达系统
• 1.3 抗菌肽的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要酶类及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因的设计与合成
• 2.2.2 表达载体的构建和鉴定
• 2.2.3 pMAL-c2X-BhSGAMP-1-S 连接产物转化及筛选鉴定
• 2.2.4 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.5 融合蛋白的纯化
• 2.2.6 重组蛋白BhSGAMP-1-S 的纯化
• 2.2.7 重组抗菌肽BhSGAMP-1-S 的活性鉴定
• 第三章 BhSGAMP-1-S 的表达与纯化
• 3.1 BhSGAMP-1-S 基因设计与人工合成
• 3.2 重组表达载体的构建
• 3.3 融合蛋白的表达及条件优化
• 3.3.1 重组融合蛋白MBP-BhSGAMP-1-S 的表达分析
• 3.3.2 常规表达条件的优化
• 3.4 目的蛋白的纯化
• 3.4.1 重组融合蛋白MBP-BhSGAMP-1-S 的表达纯化
• 3.4.2 肠激酶切割融合蛋白
• 3.4.3 重组抗菌肽BhSGAMP-1-S 的纯化
• 3.4.4 蛋白含量和回收率测定
• 3.5 小结与讨论
• 3.5.1 小结
• 3.5.2 讨论
• 第四章 BhSGAMP-1-S 抑菌活性分析
• 4.1 抑制细菌活性鉴定
• 4.2 抑制真菌活性鉴定
• 4.3 小结与讨论
• 4.3.1 小结
• 4.3.2 讨论
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 中英文缩略词对照表
• 致谢
• 作者简介