大肠杆菌f2噬菌体多克隆抗体的研制及应用

论文摘要

大肠杆菌f2噬菌体是一种RNA病毒,其有些特性与肠道病毒极为相似,能像粪大肠菌群那样在人和动物的肠道中存在,且其在水中的存活时间、对氯消毒的抵抗力也与脊髓灰质炎病毒相近。因此,国内外研究人员认为,大肠杆菌f2噬菌体是一种比较理想的水中肠道病毒污染的指示物,并将它广泛用于饮用水消毒效果评价,污水与环境水体中肠道病毒浓度、存活状况评估,环境监测方法与技术研究等方面。传统的f2噬菌体检测方法有浊度比色、空斑实验等,后者既可定性也可定量,是一种常用的实验方法。但是,它需要培养宿主菌和严格的无菌操作等繁琐过程。寻找更加简单、快捷、经济、可靠的f2噬菌体检测方法,是研究者不懈努力的方向。大量研究资料表明,能够满足上述检测要求的可行方法,有免疫层析、ELISA等免疫学方法。但是到目前为止,针对f2噬菌体相关报道几乎未见。因此,本研究尝试制备兔抗f2噬菌体多克隆抗体,以摸索出一条制备其抗体的方法和途径,为相关的单克隆抗体制备及f2噬菌体的检测研究提供最基础的实验素材。f2噬菌体为不含包膜的病毒颗粒,核衣壳表面含有丰富的抗原决定簇,用它免疫动物,不同的抗原决定簇能刺激不同的淋巴细胞而产生针对不同决定簇的抗体。通过筛选可以获得具有高亲和力多克隆抗体。本研究以大肠杆菌f2噬菌体为免疫原,以日本大白兔为受试动物,采用皮下多点注射的方式制备多克隆抗体,并通过纯化,获得了高浓度、高效价的兔抗f2噬菌体IgG。初步探讨了将多克隆抗体与微磁珠结合,浓集、分离水中大肠杆菌f2噬菌体的过程,为水中病毒检测提供相关参考数据。第一部分大肠杆菌f2噬菌体多克隆抗体的研制目的:制备大肠杆菌f2噬菌体多克隆抗体,分离纯化抗体。方法:增殖f2噬菌体,利用超速离心的方法纯化f2噬菌体,选择3只8周龄纯种大白兔,采用皮下注射法,多次多点注射纯化的大肠杆菌f噬菌体,用血清中和试验与间接ELISA法检测抗血清效价,当效价在1:3200以上时从主动脉收集血液。分离血清,用饱和硫酸铵、离子交换层析法（DEAE-纤维素,DE52）进一步纯化,得到IgG;并通过紫外分光光度计扫描测定纯化的IgG浓度。结果:受试动物经过全程免疫,获得高效价多克隆抗血清,血清中和试验效价大于1:16000,间接ELISA检测效价达到1:5000。结合离子交换层析和饱和硫酸铵纯化获得高浓度、高效价的IgG;经过血清中和试验与间接ELISA检测纯化后的抗血清IgG效价没有降低,保留了较好的活力;利用紫外分光光度计扫描测定的IgG浓度达到23.11mg/ml,满足了后续试验的基本要求。结论:成功制备兔抗f2噬菌体多克隆抗体并纯化为IgG,抗体具有较好的效价和特异性,为进一步开展对大肠杆菌f2噬菌体的检测研究提供了重要技术支持。第二部分构建免疫磁珠浓集分离水中大肠杆菌f2噬菌体目的:构建免疫磁珠,为检测水中f2噬菌体及相关研究提供一种新的浓集、分离水中病毒的方法。方法:将兔抗f2噬菌体IgG与微磁珠化学偶联构建免疫磁珠,吸附水中f2噬菌体,磁性分离免疫磁珠-噬菌体复合物,然后洗脱免疫磁珠结合的噬菌体,空斑实验检测f2噬菌体。改变洗脱液pH,观察不同pH对免疫磁珠捕获病毒洗脱效果的影响。结果:通过化学偶联方法将抗体包被到磁珠上效果良好,免疫磁珠对f2噬菌体的吸附效率约50%以上,但洗脱效率存在差异,约30%的f2噬菌体可从免疫磁珠上洗脱下来;不同pH值洗脱液洗脱效果不一样,在pH值接近2.7时效果较好。结论:本实验通过化学偶联法成功构建免疫磁珠,并获得了较好的捕获病毒效果,但洗脱解离效率偏低,因此洗脱液及洗脱条件的选择是本研究提高病毒回收率关键因素之一。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 大肠杆菌 f2 噬菌体多克隆抗体的研制
• 试剂与材料
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 构建免疫磁珠浓集分离水中大肠杆菌 f2 噬菌体
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 单克隆抗体的制备技术及应用进展
• 附件
• 致谢