环介导恒等温扩增技术快速检测大肠菌群的研究

论文摘要

食品安全是目前全世界重点关注的问题,而大肠菌群作为食品微生物污染的常见致病菌之一,国内外都将其用作食品、水体污染的常用指示菌,并以其评价和判断食品被粪便污染的程度和有无肠道致病菌污染的可能。现阶段检测大肠菌群的方法不少,但大多为传统方法,时间长,操作繁琐,因此,大肠菌群的快速检测技术研究具有较高的应用价值。环媒恒温基因扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术使用一套（6条）可以识别目的基因序列的6个特定区域特异性引物,在恒定温度条件下进行基因扩增。其操作作简单、快速、特异性高等优点,成为可代替PCR等传统检测方法的新核酸扩增技术。本研究课题针对大肠菌群的特异性B-葡萄糖醛酸酶基因序列,采用LAMP在线引物设计软件设计了5组不同的LAMP引物,通过引物特异性筛选,最终确定一组引物研究使用。在此引物的前提下进一步优化LAMP反应条件,确定了实验最佳LAMP反应体系为：0.2μM外引物F3和B3各1μL,1.6μM内引物FIP和BIP各1 μL,再加上0.2μM环引物LF和LB各1μL,2.5μM dNTPs 1μL, Bst DNA聚合酶4U,1 X Thermopol Buffer2.5μL,1.2M Betaine 5μL,ddH2 O5μL。扩增反应温度为64℃,反应时间为60min。在优化后的LAMP反应体系和反应条件下,以大肠杆菌DNA模板的梯度稀释液作为检测模板,进行LAMP扩增灵敏性的研究。实验结果表明当模板稀释液为10-7时,仍有扩增条带出现,相对PCR法在稀释度为10-6时就已经没有了扩增条带产生,验证了在灵敏性上,LAMP法优于传统PCR法。LAMP扩增产物通过沉淀反应和颜色反应。在短时间内能得出准确的检测结果

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 立题的背景和意义
• 1.2 大肠菌群简介
• 1.2.1 大肠菌群生物学特征
• 1.2.2 大肠菌群致病性
• 1.3 大肠菌群检测研究现状
• 1.3.1 传统方法
• 1.3.2 酶活性检测法
• 1.3.3 纸片法
• 1.3.4 免疫学方法
• 1.3.5 聚合酶链反应技术
• 1.3.6 Hygicut载片培养法
• 1.4 环介导等温扩增（LAMP）技术
• 1.4.1 LAMP技术简介
• 1.4.2 LAMP法的引物设计
• 1.4.3 LAMP法的扩增机制
• 1.4.4 LAMP法的基本特点
• 1.4.5 LAMP的产物检测
• 1.4.6 LAMP国内外现状和发展趋势
• 2 试验用菌的鉴定以及培养
• 2.1 大肠菌群鉴定培养
• 2.1.1 实验设备
• 2.1.2 培养基和试剂
• 2.1.3 大肠菌群MPN计数法检验
• 2.2 金色葡萄球菌鉴定培养
• 2.2.1 设备和材料
• 2.2.2 培养基和试剂
• 2.2.3 金色葡萄球菌检验培养
• 2.3 志贺氏菌的鉴定培养
• 2.3.1 实验设备
• 2.3.2 培养基和试剂
• 2.3.3 志贺氏菌检测培养
• 2.4 沙门氏菌检测培养
• 2.4.1 实验设备
• 2.4.2 实验培养基和试剂
• 2.4.3 沙门氏菌检验程序
• 3 LAMP技术快速检测大肠杆菌反应
• 3.1 大肠菌群目的基因的选择以及引物设计
• 3.1.1 目的基因序列
• 3.1.2 引物设计结果
• 3.1.3 引物筛选试验
• 4 LAMP条件优化实验
• 4.1 实验设备试剂
• 4.1.1 实验主要设备
• 4.1.2 实验主要试剂
• 4.2 最适引物添加量
• 4.3 最适底物添加量
• 4.4 最适Bst DNA聚合酶添加量
• 4.5 最适扩增反应甜菜碱浓度
• 4.6 最适扩增反应温度
• 4.7 最适扩增反应时间
• 4.8 条件优化结果与分析
• 4.9 LAMP技术灵敏性的研究
• 5 LAMP扩增产物快速鉴定方法的研究
• 5.1 沉淀反应
• 5.2 颜色反应
• 5.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果
• 致谢