[Ca2+]i和ROS在氟化钠致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的关系研究

论文摘要

地方性氟中毒是一种严重危害人体健康的全身性疾病,过量摄入氟除引起氟斑牙和氟骨症外,还可造成全身软组织的广泛损伤。大量研究结果表明,活性氧（reactive oxygen species, ROS）在氟的毒性作用机制中起重要作用。实验研究也发现慢性氟中毒可引起细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的升高,[Ca2+]i异常升高可引起细胞的急慢性损伤和死亡。[Ca2+]i与ROS之间有着错综复杂的关系,它们是紧密偶联的。ROS可引起细胞内贮存Ca2+的细胞器如内质网、线粒体膜和胞膜的破坏,导致胞内Ca2+重分布和胞外Ca2+的内流,从而引起细胞内持续的Ca2+水平升高。ROS和Ca2+都可诱发线粒体通透性转变孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）开放,MPTP开放一方面使ROS大量升高,另一方面也使线粒体外膜破裂导致膜间腔Ca2+释放,而胞浆Ca2+的大量升高作为第二信使,启动多条信号转导途径,亦会使ROS升高。ROS的产生堆积和胞内Ca2+水平的升高都是细胞损伤中的重要事件,且两者相互促进,在细胞损伤中发挥重要作用,因而ROS与[Ca2+]i的关系值得重视,但目前在慢性氟中毒引起的细胞损伤中ROS和Ca2+水平升高,二者哪个是始动环节哪个是继发环节?二者是因果联系还是平行关系目前尚未见报道。因此,本研究拟用不同浓度的氟化钠（NaF）对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞进行染毒,观察NaF对SH-SY5Y细胞[Ca2+]i、ROS和培养液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenate, LDH）的影响,以及加入胞内钙离子螯合剂（1,2-bis-（2-aminophenoxy）- ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetrakis （acetoxy-methyl） ester, BAPTA-AM）、胞外钙离子螯合剂乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol-bis-（beta-aminoethyl ether）-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, EGTA）、抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨（N-acetyl-L-cysteine, NAC）后,细胞[Ca2+]i、ROS水平和培养液中LDH水平的变化情况,从而探讨[Ca2+]i和ROS在NaF致SH-SY5Y细胞损伤中的关系,为进一步研究氟的毒性作用机制奠定基础。本研究主要由以下两部分组成第一部分NaF对SH-SY5Y细胞毒性、[Ca2+]i和ROS水平的影响目的利用体外实验方法探讨NaF对SH-SY5Y细胞的细胞毒性、[Ca2+]i和ROS水平的影响,找出[Ca2+]i和ROS升高的峰值时间点。方法SH-SY5Y细胞暴露于20、40、80μg/ml NaF,以荧光探针4-（6-Acetoxymethoxy-2,7-dichloro-3-oxo-9-xanthenyl）-4’-methyl -2,2’（ethylenedioxy）dianiline-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetrakis（acetoxymethyl） ester （Fluo-3/AM）负载,通过激光共聚焦显微技术（Laser scanning confocal microscope, LSCM）连续监测[Ca2+]i水平的变化;用比色法检测细胞培养液中LDH水平和流式细胞术（flow cytometryl, FCM）检测胞内ROS的变化。选择适宜剂量用流式细胞术检测在不同染毒时间点SH-SY5Y细胞胞内Ca2+、ROS的变化。结果40、80μg/ml NaF作用SH-SY5Y细胞24 h后细胞培养液中LDH、细胞内ROS水平均显著高于对照组（P<0.05, P<0.05）。对照组与20μg/ml NaF剂量组[Ca2+]i在2 h内没有明显变化;在40μg/ml NaF剂量组,氟作用5000 s左右时[Ca2+]i缓慢上升,之后上升幅度增大,约6000 s时达到高峰,持续至10000 s,然后开始下降;在80μg/ml NaF剂量组,一开始[Ca2+]i就急剧上升,约2500 s达到高峰,然后迅速下降。40μg/ml NaF剂量组[Ca2+]i在不同时间点与对照组相比均显著升高（P<0.05）;细胞内ROS水平除3 h外其他各时间点与对照组相比均显著升高（P<0.05）;[Ca2+]i、ROS达到峰值的时间点分别为3 h和12 h。结论NaF可诱导SH-SY5Y细胞膜的损伤、引起[Ca2+]i和ROS水平的升高,[Ca2+]i和ROS水平升高的峰值时间点分别为3 h和12 h。第二部分[Ca2+]i和ROS在NaF致SH-SY5Y细胞损伤中的关系研究目的探讨[Ca2+]i和ROS在NaF致SH-SY5Y细胞损伤中的关系。方法用胞内钙离子螯合剂（BAPTA-AM）、胞外钙离子螯合剂（EGTA）、抗氧化剂（NAC）分别与40μg/ml NaF联合培养,3、12、24 h后分别检测细胞[Ca2+]i、ROS和细胞培养液中LDH水平的变化情况。结果与40μg/ml NaF单独染毒相比,在3 h时BAPTA-AM可使[Ca2+]i水平下降（P<0.05）,NAC与EGTA对[Ca2+]i水平没有明显影响（P>0.05）;在12 h NAC与BAPTA-AM分别使ROS水平明显下降（P<0.05）,而EGTA对ROS水平没有明显影响（P>0.05）;在24 h NAC与BAPTA-AM可使细胞培养液中LDH水平明显下降（P<0.05）,EGTA对LDH水平没有明显影响（P>0.05）。结论NaF诱导SH-SY5Y细胞损伤的机制可能是通过胞内钙库的释放提高[Ca2+]i水平,升高的[Ca2+]i促使ROS的产生,二者共同对细胞产生毒性,导致细胞培养液LDH水平升高。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 2+]_i和ROS 水平的影响'>第一部分 NaF 对SH-SY5Y 细胞毒性、[Ca²⁺]_i和ROS 水平的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 2+]_i 和ROS 在 NaF 致SH-SY5Y 细胞损伤中的关系研究'>第二部分 [Ca²⁺]_i 和ROS 在 NaF 致SH-SY5Y 细胞损伤中的关系研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢