论文摘要
猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）是我国猪链球菌病的重要病原,不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可感染相关人员并致死,是一种重要的人畜共患病病原。目前国内外对SS2的研究主要集中在其毒力相关因子上,公认的毒力相关因子有溶菌酶释放蛋白（muramidase released protein,MRP）、胞外蛋白因子（extracellular factor protein,EF）、溶血素（suilysin,SLY）、荚膜多糖（capsular polysaccharide,CPS）等。乳酸菌是一种公认安全的（generally regards as safe,GRAS）食品级微生物,能作为活疫苗抗原传递载体为探讨SS2的重要毒力因子MRP和EF在乳酸菌中的表达及其用作口服疫苗的可行性,本研究克隆了epf、mrp抗原性较高的部分片段,将其分别与启动子P59和信号肽SPUsp45连接,最终构建了EF的组成型分泌表达载体pHL301、MRP的组成型分泌表达载体pHL302;分别与诱导型启动子Pnisz和SPUsp45连接,获得了EF的诱导型表达载体pHL401、MRP的诱导型表达载体pHL402。同时并将epf、mrp基因串联构建了EF-MRP组成型表达载体pHL500和诱导型表达载体pHL600。将构建的组成型表达载体pHL301、pHL302分别转化至Lactococcus lactis MG1363、Lactobacillus casei ATCC27092、Lactobacillus brevis ATCC 8287、Lactobacillus acidophillus HLA、Lactobacillusplantarum NCIMB8826中,诱导型表达载体pHL401、pilL402、pnL600转化至L.lactis NZ9000中,pilL500转化至Lb.plantarum NCIMB8826中,通过Westernblotting检测蛋白的表达情况。EF、MRP在各重组菌中均得到了不同程度的表达,特别是在重组Lb.casei ATCC27092中,EF和MRP蛋白在细菌生长的各阶段都能很好的表达:在重组Lb.plantarum NCIMB8826中,蛋白基本全部分泌至培养基中,且分泌表达时间长,甚至在OD600=1.6时仍能很好的表达;在重组L.lactisNZ9000中,蛋白表达量相对更高。将含有表达EF、MRP的重组Lb.casei ATCC27092、Lb.plantarumNCIMB8826、L.lactis NZ9000菌体口服饲喂C57BL/6J小鼠,发现Lb.caseiATCC27092/pHL301能刺激小鼠发生免疫反应产生EF特异性抗体,Lb.caseiATCC27092/pHL302能刺激小鼠产生MRP特异性抗体,而其他重组菌抗体水平很低,或者根本检测不到抗体的产生。上述试验结果说明,表达EF或MRP的Lb.casei ATCC27092均能对小鼠产生保护作用,而重组Lb.plantarumNCIMB8826、L.lactis NZ9000菌却未能达到预期的效果。