不同来源的谷胱甘肽合成酶对重组毕赤酵母合成谷胱甘肽的影响研究

论文摘要

谷胱甘肽,γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸（γ-L -glutamyl-L-cysteinyl-gly- cine,GSH）,广泛存在于真核生物、革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌中,具有重要的生理功能和应用前景。微生物发酵法是目前谷胱甘肽生产的主要方法之一,它具有生产成本低,步骤简单、无需外源添加ATP等优点。发酵法所用菌株主要是经诱变育种得到各种酵母菌,包括酿酒酵母、产朊假丝酵母等。近几年,重组毕赤酵母开始应用于谷胱甘肽合成,由于该酵母遗传操作简便、极易在廉价培养基上实现高密度培养,因此已初步显示出其在谷胱甘肽生产上的应用价值与前景。用于谷胱甘肽生产的重组毕赤酵母菌株,是通过在毕赤酵母宿主中过表达催化谷胱甘肽合成酶的基因构建而成,而选择理想的（如催化效率高、无产物抑制等）谷胱甘肽合成酶进行过表达,也是提高毕赤酵母生产谷胱甘肽产率的先决条件。为得到相对理想的谷胱甘肽合成酶,最为简单实用的方法之一是在毕赤酵母中尝试表达各种微生物来源的谷胱甘肽合成酶基因,考察这些合成酶对于毕赤酵母生产谷胱甘肽的影响。之前的研究只报道过在毕赤酵母中表达来源于酿酒酵母模式菌株S288c的L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶（GS）基因。本论文考察了六种菌株来源的谷胱甘肽合成酶基因,研究了它们对毕赤酵母生产谷胱甘肽的影响。特别的,首次评估了革兰氏阳性菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶基因（gshF）在毕赤酵母转化法生产谷胱甘肽中的应用潜力。具体研究内容包括:首先,考察了酿酒酵母模式菌S288c,安琪酵母工业菌株和产朊假丝酵母来源的γ-GCS基因gsh1的过表达对于谷胱甘肽产量的影响。通过将上述酵母的gsh1基因和酿酒酵母来源的GS的基因gsh2分别克隆并插入到毕赤酵母GS115基因组内进行表达。不加三种前体氨基酸摇瓶发酵结果发现它们的重组子合成的GSH分别是出发菌的2.2倍、4.3倍和4.4倍,加入三种前体氨基酸后,对照组及重组子合成GSH的稳定产量分别是116 mg/L、256 mg/L、426 mg/L和438 mg/L。结果表明来源于模式菌S288c和产朊假丝酵母的γ-GCS基因对谷胱甘肽合成的催化效率更高。其次,考察了来源于革兰氏阳性菌Listeria monocytogene、Lactobacillus plantarum和Streptococcus agalactia的双功能谷胱甘肽合成酶基因（gshF）对于毕赤酵母产谷胱甘肽的影响。将L. monocytogenes、L. plantarum和S. agalactiae来源的gshF分别克隆并插入到毕赤酵母GS115基因组内,得到三株重组菌株GS115/Lm-gshF GS115/Sa-gshF和GS115/ Lp-gshF。摇瓶发酵结果发现只有含L. monocytogene gshF基因的重组子GS115/Lmg-shF合成的GSH是出发菌的2.8倍,GS115/SagshF、GS115/ LpgshF两重组子合成的GSH与出发菌相比没有区别,在添加三种前体氨基酸的情况下,GS115/Lm-gshF合成GSH的最高产量达到336 mg/L,表明L. monocytogenes来源的gshF在毕赤酵母转化法生产谷胱甘肽上具有较好的应用潜力。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 谷胱甘肽概述
• 1.1.1 谷胱甘肽
• 1.1.2 GSH 的生理功能
• 1.1.3 谷胱甘肽的应用
• 1.2 谷胱甘肽的生产研究及现状
• 1.2.1 萃取法
• 1.2.2 化学合成法
• 1.2.3 酶法合成GSH
• 1.2.4 发酵法生产GSH
• 1.3 毕赤酵母
• 1.4 本课题研究内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 所用菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 引物设计
• 2.2 分子生物实验方法
• 2.2.1 PCR 扩增GSHI、GSHII 基因及gshF 基因
• 2.2.2 质粒提取
• 2.2.4 PCR 产物纯化、核酸电泳和目的片段切胶回收
• 2.2.5 基因的PCR 纯化产物和质粒双酶切
• 2.2.6 基因双酶切后纯化产物和质粒双酶切胶回收后产物连接
• 2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与电转化
• 2.2.8 酵母感受态细胞的制备与电转化
• 2.2.9 菌落PCR 验证
• 2.2.10 基因组提取
• 2.2.11 毕赤酵母细胞破碎
• 2.3 实验分析
• 2.3.1 菌体浓度测定
• 2.3.2 SDS-PAGE 蛋白电泳
• 2.3.3 GSH 的测定
• 第三章 不同酵母来源的谷胱甘肽合成酶对重组毕赤酵母法生产谷胱甘肽的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 载体pGAPZαH 的构建
• 3.2.2 表达载体pGAPZαHScIGSH 的构建
• 3.2.3 表达载体pGAPZαHScIIGSH 的构建
• 3.2.4 表达载体pGAPZαHCuGSH 的构建
• 3.2.5 表达载体线性化
• 3.2.6 电转化毕赤酵母
• 3.2.7 重组菌株菌落PCR 验证
• 3.2.8 重组菌GSHI 和GSHII 基因的表达
• 3.2.9 重组菌合成GSH
• 3.2.10 重组菌合成GSH 的稳定性检测
• 3.2.11 底物氨基酸对合成GSH 的影响
• 3.2.12 重组菌G5115/ScIGSH 1 L 罐发酵生产GSH 的初步研究
• 3.3 本章小结
• 第四章 双功能谷胱甘肽合成酶对重组毕赤酵母法生产谷胱甘肽的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验结果与讨论
• 4.2.1 L monocytogenes gshF 基因的克隆
• 4.2.2 S agalactiae、L plantarum gshF 基因的克隆及表达载体的构建
• 4.2.3 表达质粒线性化及电转化毕赤酵母
• 4.2.4 重组菌株菌落PCR 验证
• 4.2.5 重组菌gshF 的表达
• 4.2.6 重组菌合成GSH
• 4.2.7 重组菌合成GSH 的稳定性检测
• 4.2.8 重组菌合成GSH 的动态分析
• 4.2.9 底物氨基酸对合成GSH 的影响
• 4.2.10 GSH 的降解
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果