论文摘要
背景：据世界卫生组织统计，癌症居各类常见死因的前列。恶性肿瘤中的胶质瘤难治愈易复发，多数患者存活期仅为一年左右。目前治疗肿瘤的多种化疗药物主要是通过影响肿瘤细胞周期和诱导细胞凋亡来达到抑制肿瘤细胞的增殖的目的，其中通过不同方式增强化疗药物的抗癌作用并降低其细胞毒性的研究可以为肿瘤生物学及肿瘤化疗提供一些理论依据和试验参考。目的：观察传统抗癌药物顺铂和天然提取物海带硫酸多糖的单独或联合作用下，对体外培养的大鼠胶质瘤C6细胞系生长抑制及其作用机制，以期在细胞水平上为治疗癌症提供相关的理论依据。方法：对C6体外增殖的影响：采用形态学观察、细胞计数法检测不同药物作用下，C6细胞形态变化及细胞存活率。对C6细胞凋亡的影响：用Hoechst33258染色法和吖啶橙染色法，在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化和凋亡小体；通过测定培养液中LDH的含量来检测细胞膜完整性，以此区别凋亡和坏死。P53蛋白表达测定：免疫荧光结合激光共聚焦扫描显微测定细胞中P53的表达变化。对C6细胞内活性氧含量的测定：将不同药物处理过的细胞收集后，用荧光分光光度计测其细胞内活性氧的含量。对细胞周期的影响：流式细胞术测定体外培养的C6细胞在不同药物处理之后细胞周期和凋亡率的变化。结果：1．相差显微镜观察显示：顺铂和海带硫酸多糖单独作用之后细胞形态变化较小，二者联用时，细胞形态明显变小，细胞数量明显减少并且出现凋亡。顺铂单用及和海带硫酸多糖联用时细胞都表现出凋亡的特征，即细胞突起变少，细胞中颗粒和空泡增加，细胞核明显增大。联用的凋亡效果较单用的凋亡效果明显。顺铂单用的坏死较联用的坏死效果明显。2．细胞计数：顺铂和海带硫酸多糖单独作用于C6时，细胞增殖都呈现时间及剂量依赖性；顺铂与海带硫酸多糖联用时抑瘤效果明显增强(P＜0.01)。3．用荧光显微镜观察，海带硫酸多糖单独作用时细胞凋亡现象极不明显，顺铂单独作用时有细胞凋亡，但不显著。二者联用可使大量细胞凋亡或坏死。凋亡细胞的细胞核中染色质凝集并边缘化，或者断裂为大小不等的片断。海带硫酸多糖作用48小时后的C6细胞的死亡形式是凋亡。4．LDH活性检测表明，顺铂和海带硫酸多糖合用时与顺铂单独使用相比LDH活性无显著差异(P＞0.05)。5．C6细胞内ROS活性的测定：将不同药物处理过的细胞收集后，用荧光分光光度计测其细胞内活性氧的含量，顺铂和海带硫酸多糖单独使用较联合使用，细胞内活性氧的含量低，但差异不显著。6．P53的免疫荧光染色表明：与对照组相比较，海带硫酸多糖组差异不明显(P＞0.05)；顺铂组有明显差异(P＜0.05)；顺铂组中p53表达量比海带硫酸多糖组中高。联合用药时p53表达量比单一用药时增加，差异显著(P＜0.05)。7．流式细胞仪检测细胞周期显示：与对照组比较，海带硫酸多糖组G1期细胞增多，顺铂组G2期细胞增多，联合用药组，细胞周期阻滞于S期。结论：1、顺铂和海带硫酸多糖联合使用，较单独使用时对C6的杀伤力显著提高。2、细胞的死亡方式：顺铂与海带硫酸多糖联用时可降低单独使用顺铂时C6的坏死数量，但差异不显著。3、顺铂与海带硫酸多糖单独或联合作用于C6的抑瘤作用都增加细胞内活性氧含量4、顺铂与海带硫酸多糖联合对C6的抑制作用与p53蛋白的表达上调有关。5、海带硫酸多糖使细胞周期阻抑在G1／S期，顺铂使细胞周期阻抑在G2／M期，联合用药使细胞周期阻抑在S期。