论文摘要
POKemon（POK erythroid myeloid ontogenic factor）是由zbtb7基因编码的POK家族蛋白，位于19 p 13.3，所在位点是染色体易位的热点，其羧基末端有Kruppel-type类锌指结构DNA结合域，氨基末端有POZ结构域。POK蛋白家族在胚胎发育、分化、肿瘤发生中起着重要作用。Maeda T等报道：POKemon在MEFs（mouse embryonic fibroblast cells）的瘤性转化中是一个关键因子，并且与其它癌基因协同作用促进肿瘤的发生。POKemon直接与p19ARF启动子连接并抑制其转录，最终引起p53表达下调，证实存在一个基因调控链，并表明POKemon是一个新的癌基因。p14 ARF是细胞周期素依赖性激酶（CDK4）的抑制蛋白基因INK4a的可变阅读框基因，定位于9p21，由3个外显子（Exon1，Exon2，Exon3）和两个内含子组成，三者共同编码分子量为14Kd的蛋白即p14ARF（在小鼠中同源物为p19ARF），由133个氨基酸组成，主要与mdm2结合，阻止其从胞核穿梭到胞浆，从而恢复和稳定细胞p53水平，增强p53在G1-S和G2-M的限制点效应，最终使细胞滞于G1与G2期。目前国外研究均集中于POKemon在正常细胞中的功能及机制，阐述了POKemon在肿瘤发生中的关键作用，国内尚未见POKemon研究文献报道。POKemon在大肠癌中是否有表达亦未见国内外文献报道。我们以大肠癌为研究对象，探讨Pokemon及相关靶基因（p14ARF）在人大肠癌细胞及组织中的表达规律，分析其表达与肿瘤分型、组织学分级、临床分期、肿瘤转移的相关关系，探讨其作为生物学标志物（biomarkers）的临床价值。本研究从mRNA水平用RT-PCR方法检测Pokemon、p14ARF两个基因的转录状况，结果显示：五株大肠癌细胞中，POKemon在四株细胞（SW480、SW480／M5、SW620、LOVO）中有转录，p14ARF在一株细胞（HCT116）中转录。又从蛋白水平用免疫细胞方法检测两个基因的表达情况，结果显示：Pokemon蛋白在四株细胞中（SW480、SW480／M5、SW620、LOVO）有表达，p14ARF在一株细胞（HCT116）阳性表达。以上结果表明：POKemon基因无论在mRNA水平还是在蛋白水平均具有较普遍性的表达，p14ARF基因总体上表达减弱，且二者的表达状态相反，由此提示，Pokemon作为癌基因在大肠癌发生发展过程中可能具有重要作用，而p14ARF则可能与Pokemon作用相反。初步结果显示，Pokemon-p14ARF基因调控链亦存在于大肠癌细胞中，可能参与了大肠粘膜细胞的癌变及其他生物学过程。为了进一步探讨Pokemon、p14ARF在大肠癌组织中的表达情况及二者相互作用关系，本研究收集55例大肠癌组织，并以取自同一患者的正常粘膜组织作为参照，患者术前均未进行任何放化疗，在同一遗传背景下，从蛋白水平用免疫组织化学方法检测其表达情况。在对Pokemon、p14ARF在人类正常粘膜和大肠癌组织中的表达情况的研究中，结果显示：55例患者中，POKemon在10例正常粘膜组织中阳性表达，阳性率为18.18％；在46例腺癌组织中阳性表达，阳性率为83.64％；。对POKemon在正常粘膜组织和腺癌组织的阳性率进行x2检验，可知POKemon在腺癌组织的表达高于正常粘膜组织，统计学分析有显著性差异（x2=47.143，P=0.000）。在癌组织中的过表达，提示POKemon在人大肠正常粘膜到腺癌的基因事件中，作为促癌基因发挥重要作用，与癌的发生密切相关。55例患者中，p14ARF在54例正常粘膜组织中阳性表达，阳性率为98.18％；p14ARF在43例腺癌组织中阳性表达，阳性率为78.18％。对p14ARF在两种组织的阳性率进行x2检验，可知p14ARF在腺癌组织的表达低于正常粘膜组织，统计学分析有显著性意义（x2=10.555，P=0.001）。该结果提示p14ARF在正常粘膜组织中，阳性表达率高，发挥抑癌基因作用；在癌组织中表达下调，它对mdm2由胞核穿梭到胞浆降解p53的抑制作用同时受到抑制，在癌的发生过程中发挥了重要作用。POKemon在分化程度不同的癌组织中的表达统计分析，用Kruskal-Wallis H检验方法，P=0.006有显著差异，根据平均秩次推断，以低分化癌中POKemon的表达强度最高。用spearman秩相关进行分析，结果示POKemon表达强度与癌组织分化程度呈负相关，R=-0.360，P=0.007有统计学意义。用Mann-Whitney U检验方法，结果显示POKemon在有无转移癌组织中的表达强度没有显著性差异，P=0.228，没有统计学意义。用spearman秩相关进行分析，结果示POKemon表达强度与癌组织是否转移无相关关系。用Mann-Whitney U检验方法，结果显示POKemon的表达强度在Duke’s不同分期的癌组织中无显著性差异，P=0.228，无统计学意义。用spearman秩相关进行分析，结果示POKemon表达强度与癌组织临床分期无相关关系。以上结果提示：POKemon的表达强度与分化程度呈负相关，分化程度低者，倾向POKemon有较高的表达水平；POKemon阳性与转移与否、Duke’s分期无关。p14ARF与临床病理的关系统计分析结果：用x2检验fisher确切概率法结果显示P14ARF在分化程度不同癌组织中的阳性表达率有显著性差异，P=0.031，有统计学意义，且p14ARF的阳性表达与分化程度呈负相关，R=-0.321，P=0.014。分化程度高者，p14ARF有较高的表达。用Mann-Whitney U检验方法，结果显示p14ARF在有无转移癌组织中的表达强度没有显著性差异，P=0.228，没有统计学意义。用spearman秩相关进行分析，结果示p14ARF表达强度与癌组织是否转移无相关关系，用Mann-Whitney U检验方法，结果显示P14ARF的表达强度在Duke’s不同分期的癌组织中无显著性差异，P=0.534，无统计学意义。用spearman秩相关进行分析，结果示p14ARF表达强度与癌组织临床分期无相关关系。以上结果提示：p14ARF的阳性表达与分化程度相关，提示p14ARF蛋白阳性表达与大肠癌的发生恶性生物学行为有关。本研究在对POKemon与p14ARF两个基因在正常粘膜中的功能关联分析中，结果显示：55例患者正常粘膜组织中，POKemon与p14ARF均阳性者为9例，POKemon与p14ARF均阴性者为0，POKemon阳性p14ARF阴性者有1例，POKemon阴性p14ARF阳性者有45例，作阳性率相关分析，结果显示：POKemon与p14ARF的正常粘膜组织中的表达呈负相关，相关系数R=-0.289，P=0.033有统计学意义。可知在正常粘膜组织中，两基因功能间存在负相关（P=0.000，r=-0.289）。POKemon表达低者，则p14ARF表达增高。POKemon作为转录抑制因子，抑制了p14ARF基因的转录，间接地调控着p53的表达。该结果显示在正常粘膜组织中，POKemon表达下调，p14ARF过表达，提示了POKemon-p14ARF基因调控通路的存在。对POKemon与p14ARF两个基因在大肠癌组织中的功能关联分析中，结果显示：55例患者腺癌组织中，POKemon与p14ARF均阳性者为32例，POKemon与p14ARF均阴性者为0，POKemon阳性p14ARF阴性者有12例，POKemon阴性p14ARF阳性者有11例，作POKemon和P14ARF阳性率进行相关分析，结果显示POKemon与P14ARF的大肠癌组织中的表达呈负相关，相关系数R=-0.981，P=0.000有统计学意义。POKemon表达增高时，则p14ARF表达下调，提示在腺癌组织中，POKemon仍抑制p14ARF的转录。总之，我们的结果表明：POKemon的增高与大肠癌的发生及分化程度密切相关，联合检测POKemon基因和其它基因表达可作为早期诊断的标志物。p14ARF在大肠癌组织中表达下调，与大肠癌的恶性生物学行为相关。二者在大肠癌的诊断、制定治疗策略中具有重要意义。
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