论文摘要
抗菌肽广泛存在于自然界生物体内,具有抗细菌、抗真菌、抗原生生物、抗病毒、抗肿瘤细胞等生物活性。由于天然抗菌肽的获取比较困难,且抗菌肽对细菌具有杀伤作用,采用常规的大肠杆菌表达体系很难实现表达。本研究根据抗菌肽的生物学特性和乳腺表达的特异性,通过建立乳腺表达系统,探索抗菌肽在反刍动物乳腺组织中的表达,明确其在乳汁中的抗菌活性,为下一步实现其在乳腺中的稳定表达及反刍动物细菌性乳腺炎的预防奠定基础。本试验首先根据已发表的天蚕素B 和牛气管抗菌肽的cDNA 序列和氨基酸序列,依据真核细胞偏爱的密码子对抗菌肽编码序列进行优化,在序列两端引入适当的酶切位点,通过重叠延伸PCR 法扩增获得这两种抗菌肽的全基因,分别将它们连接在pMD18-T 载体上,测序证明了合成的正确性。利用山羊β-酪蛋白基因5ˊ侧翼调控序列和真核基因表达载体pIRESneo,分别构建了天蚕素B 和牛气管抗菌肽的乳腺组织特异性表达载体及二者的双表达载体,将所构建的抗菌肽表达载体以生理盐水溶液形式,直接注射处于泌乳期的健康山羊乳腺小叶,注射后不同时间收集乳汁,通过Tricine-SDS-PAGE 电泳鉴定其表达,以薄层琼脂板孔穴扩散法检测表达产物抗菌活性。结果显示,乳腺组织特异性表达载体能够有效地指导天蚕素B 和牛气管抗菌肽在乳腺中的表达,表达产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有明显的抑制作用,对链球菌的抑制效果不明显,表达呈暂态性,可持续3-5 天,乳汁中抗菌肽对高温具有一定耐受性,对酸碱具有较强的抗性,反复冻融可降低抗菌肽的活性。
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