论文题目: 冬虫夏草无性型培养与鉴定及其抗肿瘤机制的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 刘彦威
导师: 赵德明,苏敬良
关键词: 冬虫夏草无性型,培养,鉴定,甘露醉,多糖,抗肿瘤机制
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 天然冬虫夏草是一种名贵的中药,资源短缺。为此,本实验探讨了人工冬虫夏草无性型的培养;同时,对无性型进行了鉴定,测定了其有效成分,并探讨了人工冬虫夏草抗肿瘤机制,为人工冬虫夏草替代天然冬虫夏草奠定了基础。 收集冬虫夏草子实体弹射的子囊孢子,将单个萌发孢子接种到培养基上,成功分离到冬虫夏草菌。同时观察了温度、pH值、通气、碳源、氮源和摇菌对菌丝生长特性的影响,结果显示冬虫夏草茵丝体为需氧菌,生长缓慢,可自发荧光,能分泌棕褐色样物质,最适温度为15～18℃,pH值范围为5～7,适当的摇菌可提高菌丝量,碳源和氮源对菌丝量有影响,适宜的碳源为淀粉、葡萄糖和甘露醇,最佳的氮源为复合氮源;用菌丝体和子囊孢子饲喂蝙蝠蛾幼虫可获得较高的僵虫诱导率(70～76.6%);免疫组化染色显示菌丝体和僵虫体内的菌丝有共同的抗原。这些为冬虫夏草人工培养、营养的选择及用免疫方法分析提供了有价值的资料。 采用PCR及DNA测序的方法,对不同产地的冬虫夏草及其分离株和其相关种类的rDNA ITS和5.8S RNA全序列进行分析,结果表明冬虫夏草和其分离株的序列相似性为97.5～100%,分离株与中国被毛饱相似性为98.4～99.7%而与Stachybotry chartarum、Cordyceps militari、Tolypocladium caledonica、Cephalosporium maydiss、Paecilomyces sinensis、Verticillium bulbillosum、相似性最高分别为78.9%、76.7%、72.2%、68.6%、62.8%、59.5%,这些结果提示冬虫夏草和分离株是同一品种的不同生长阶段,冬虫夏草为有性阶段,而其分离株为其无性阶段,即为中国被毛饱。 用比色法测定了天然冬虫夏草、人工培养的菌丝体和北虫草甘露醇的含量,探讨了摇菌和不同氮源对冬虫夏草菌丝体甘露醇含量的影响。结果显示天然冬虫夏草的甘露醇含量高于菌丝体,而菌丝体的含量又略高于北虫草;摇菌培养使菌丝和菌液中甘露醇含量降低:不同氮源培养基对菌液液和菌丝中的甘露醇有不同的影响,最佳氮源为复合氮源。提示天然和人工冬虫夏草均含有有效成分—甘露醇,人工冬虫夏草甘露醇的含量受培养方式和营养的影响,同时,这也为人工冬虫夏草替代天然冬虫夏草提供基础数据。 硫酸—苯酚法测定了天然冬虫夏草和菌丝体多糖含量及振荡培养和不同氮源培养基对菌丝甘露醇的影响,结果发现菌丝体的多糖含稍高于天然冬虫夏草(p>0.05);振荡培养抑制菌丝多糖产生,使菌丝多糖含量降低;氮源对菌丝多糖含量有影响,较适合的氮源为复合氮源。提示冬虫夏草多糖的含量受培养方式和营养的影响,同时,也为人工冬虫夏草替代天然冬虫夏草提供基础数据。 为了探讨冬虫夏草菌丝体水提液和多糖抗肿瘤细胞(SP2/0)作用机制,应用MTT法检测细胞增殖,琼脂电泳和流式细胞仪及Hoechst33342荧光染色观察和分析了细胞凋亡,流式细胞仪分析了细胞周期,实时荧光定量RT-PCR方法检测了不同处理样品p53基因表达变化。结果发现用冬虫夏草菌丝体水提液和多糖处理培养SP2/0细胞能抑制其生长,细胞分裂被阻滞在G1/G0期,且诱导细胞凋亡,p53基因表达下调,提示由于p53基因表达的变化,引起细胞周期阻滞,导致细胞凋亡,从而抑制细胞的增值。
论文目录:
中文摘要
ABSTRAC
目录
英文缩写表
第一章 文献综述
1 冬虫夏草的概述
1.1 虫草属真菌的研究历史
1.2 虫草属真菌的种类资源
1.3 冬虫夏草的生物学特性
2 冬虫夏草有性型人工培育技术
2.1 冬虫夏草人工培育现状
2.2 半人工栽培
3 冬虫夏草无性型的研究概况
3.1 无性型的培养
3.2 已发表的冬虫夏草的无性型的名称
3.3 无性型的鉴定
4.冬虫夏草药抗肿瘤作用
4.1 在体外
4.2 在体内
4.3 抗肿瘤机制
5 冬虫夏草有效成分
5.1 虫草多糖
5.2 蛋白和氨基酸
5.3 糖醇、甾醇类
5.4 脂肪和脂肪酸
5.5 抗菌活性物质
5.6 虫草素和生物碱
5.7 微量元素
5.8 新型免疫抑制剂
5.9 其他成分
小结
第二章 冬虫夏草无性型的培养
引言
1 材料与方法
1.1 分离培养
1.2 菌丝结构的观察
1.3 子囊孢子和菌丝体感染幼虫实验
2 结果
2.1 虫草菌生长观察
2.2 菌丝显微结构
2.3 温度对菌丝生长的影响
2.4 通气对菌丝生长和结构的影响
2.5 pH值对菌丝生长的影响
2.6 荧光显微镜下观察
2.7 摇菌时间对菌丝重的影响
2.8 不同氮源对菌丝生长的影响
2.9 不同碳源对菌丝生长的影响
2.10 子囊孢子和菌丝感染幼虫实验结果
2.11 免疫组化染色
3 讨论
3.1 冬虫夏草无性型的分离及生长特性
3.2 选择碳氮源、控制摇菌时间提高菌丝产量
3.3 人工诱导僵虫
3.4 菌丝免疫组化染色特性
小结
第三章 冬虫夏草无性型的鉴定
引言
1 材料和方法
1.1 主要仪器
1.2 主要试剂
1.3 溶液的配制
1.4 研究材料和来源
1.5 真菌DNA的提取(按EZNA FungalDNAKit方法)
1.6 真菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳分析
1.7.引物设计与合成
1.8 PCR反应
1.9 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析
1.10 PCR产物的回收纯化
1.11 序列测定和数据的处理
2 结果与分析
2.1 总DNA的提取
2.2 特定区域的PCR扩增结果
2.3 序列测定结果
2.4 序列排列和数据处理分析
3 讨论
3.1 冬虫夏草无性型的分子鉴别
3.2 不同产地冬虫夏草遗传多样性分析
小结
第四章 冬虫夏草甘露醇的测定
引言
1 材料与方法
1.1 冬虫夏草甘露醇的提取
1.2 比色法测定甘露醇
1.3 氧化还原滴定法(容量法)
1.4 样品甘露醇比色法测定
2 结果
2.1 比色法
2.2 容量法
2.3 比色法和容量法测定甘露醇含量的比较
2.4 振荡培养对菌液和菌丝体甘露醇含量的影响(比色法)
2.5 不同氮源对甘露醇含量的影响(比色法)
3 讨论
3.1 不同虫草和冬虫夏草不部分甘露醇含量有差异
3.2 容量法与比色法的比较
3.3 振荡培养对甘露醇含量的影响
3.4 氮源对甘露醇含量的影响
小结
第五章 冬虫夏草多糖的提取
引言
1 材料和方法
1.1 溶液的配制
1.2 多糖的提取
1.3 多糖的测定(硫酸-苯酚法)
2 结果
2.1 供试液吸收曲线
2.2 葡聚糖线性范围
2.3 葡萄糖线性范围
2.4 冬虫夏草和菌丝体多糖的含量
2.5 不同处理多糖的影响
2.6 振荡培养对菌丝多糖的影响
2.7 氮源对菌丝多糖影响
3 讨论
3.1 冬虫夏草和菌丝多糖含量
3.2 不同处理对多糖含量的影响
3.3 摇菌抑制菌丝多糖产生
3.4 氮源对菌丝多糖影响
小结
第六章 冬虫夏草菌丝体对SP2／0细胞凋亡的作用
引言
1.材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2.结果
2.1 冬虫夏草对瘤细胞的形态影响
2.2 冬虫夏草对瘤细胞增殖影响
2.3 总DNA电泳
2.4 冬虫夏草对肿瘤细胞周期的影响
2.5 冬虫夏草对肿瘤细胞凋亡的影响
2.6 总RNA提取
2.7 cDNA制备RT-PCP扩增
2.8 实时荧光定量PCR反应结果
3 讨论
3.1 冬虫夏草菌丝水提液和多糖对肿瘤细胞抑制作用
3.2 冬虫夏草菌丝水提液和多糖诱导肿瘤细胞凋亡
3.3 冬虫夏草菌丝水提液和多糖对肿瘤细胞p53基因表达作用
小结
结论
创新
参考文献
附录
致谢
个人简介
发布时间: 2006-04-05
参考文献
- [1].35种虫草及其无性型鉴定、活性筛选和细脚拟青霉提取物的抗抑郁作用及相关机制[D]. 李春如.安徽医科大学2006
- [2].重庆低海拔虫草种及其活性物质基础研究[D]. 杨艳红.重庆大学2009
- [3].冬虫夏草无性繁殖研究及其产物对HepG2细胞凋亡的影响[D]. 田向荣.中国农业大学2013
- [4].一种新型虫草生物学及其活性物质的研究[D]. 李蓉.中国海洋大学2009
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- [5].灵芝多糖抗病毒和抗肿瘤作用机制研究[D]. 刘静.武汉大学2005
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- [7].35种虫草及其无性型鉴定、活性筛选和细脚拟青霉提取物的抗抑郁作用及相关机制[D]. 李春如.安徽医科大学2006