人参皂甙Rh2和桦木酸协同诱导肿瘤细胞凋亡的研究

论文摘要

我们首次证明,天然成分人参皂甙Rh2（G-Rh2）和桦木酸（Bet A）协同作用诱导人源宫颈腺癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549凋亡,其联合作用常数（CI值）分别为0.567,0.716,0.670。我们以HeLa为研究模型进一步探讨了该过程的分子机制。通过细胞形态测定、流式细胞检测分析、酶活性测定、RNAi技术、蛋白质定位技术、免疫印记分析等实验技术,证实了G-Rh2和Bet A的协同促凋亡作用的分子机制。即二者协同的促凋亡作用是通过增加Caspase-8的激活、Bid的断裂、Bax从胞浆至线粒体的转位,以及增加线粒体细胞色素C的释放来实现的。而且,通过siRNA技术特异干扰Caspase-8,能够有效地减少药物联合作用细胞的Caspase-9加工、PARP断裂、Caspase-3激活及凋亡,表明该细胞凋亡过程中,caspase-8/Bid的反馈放大途径行使重要的调控作用。

论文目录

• 提要
• 第一章 前言
• 1.Caspase 家族蛋白酶与细胞凋亡
• 1.1 Caspase 及其分类
• 1.2 Procaspase 的激活
• 1.2.1 死亡受体介导的Procaspase 激活途径
• 1.2.2 线粒体介导的Procaspase 激活途径
• 1.3 Caspase 的下游底物
• 1.3.1 Caspase-3、Caspase-6 和Caspase-7
• 1.3.2 Caspase 的其他下游底物
• 1.4 Caspase 家族蛋白酶调节因子
• 1.4.1 IAP
• 1.4.2 Bcl-2 家族蛋白质
• 1.4.3 细胞色素C
• 1.4.4 Smac
• 1.4.5 钙蛋白酶和钙离子
• 1.4.6 Gran B
• 2. 抗肿瘤药物的协同作用
• 2.1 抗肿瘤药物协同作用的基本原理
• 2.2 抗肿瘤药物协同作用的研究现状
• 2.2.1 药物选择的基本依据
• 2.2.2 常用的研究方法
• 3. 本论文的设计思路
• 第二章 人参皂甙Rh2 和桦木酸协同诱导肿瘤细胞凋亡的研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料、仪器和溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 MTT 法测定细胞成活率
• 2.2.3 流式细胞检测分析
• 2.2.4 染色体凝聚与核断裂分析
• 2.2.5 Caspase 活性测定
• 2.2.6 线粒体膜电位的去极化分析
• 2.2.7 全细胞裂解液的制备
• 2.2.8 线粒体及胞浆提取物蛋白质的制备
• 2.2.9 提取物蛋白质浓度的测定
• 2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.11 Western blot 分析
• 2.2.12 RNA 干扰技术
• 3. 结果与讨论
• 3.1 G-Rh2 和Bet A 协同诱导肿瘤细胞凋亡
• 3.1.1 MTT 法结果分析
• 3.1.2 协同作用分析
• 3.1.3 小结
• 3.2 G-Rh2 和Bet A 协同诱导HeLa 细胞凋亡及Caspase-3 激活.
• 3.2.1 DAPI 染色及凋亡细胞的形态学观察
• 3.2.2 Caspase-3/7 活性测定
• 3.2.3 流式细胞检测技术测定细胞凋亡
• 3.2.4 小结
• 3.3 G-Rh2 和Bet A 联合作用导致Caspase-8、Bid 和PARP 断裂的增加
• 3.3.1 全细胞裂解液蛋白质的Western blot 分析
• 3.3.2 小结
• 3.4 G-Rh2 和Bet A 协同作用HeLa 细胞迅速引起线粒体膜电位的去极化和细胞色素C 的释放
• 3.4.1 MitoCapture 试剂染色结果分析
• 3.4.2 线粒体提取液蛋白质的Western blot 分析
• 3.4.3 小结
• 3.5 G-Rh2 和Bet A 联合作用协同触发HeLa 细胞的Bax 转位
• 3.5.1 线粒体提取液蛋白质的Western blot 分析
• 3.5.2 全细胞裂解液蛋白质的Western blot 分析
• 3.5.3 小结
• 3.6 在G-Rh2 和Bet A 联合作用诱导Caspase-3 激活和细胞凋亡中，Caspase-8 起重要作用
• 3.6.1 全细胞裂解液蛋白质的Western blot 分析
• 3.6.2 DAPI 染色结果分析
• 3.6.3 Caspase-3 活性测定
• 3.6.4 小结
• 4. 本章结论
• 第三章 细胞周期蛋白质依赖性激酶CDK2 多克隆抗体的制备和鉴定
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料、仪器和溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CDK2 多肽编码基因的PCR 合成
• 2.2.2 pGEX-6P-1-CDK2 多肽重组质粒的构建
• 2.2.3 GST-CDK2 多肽融合蛋白质的表达和纯化
• 2.2.4 抗CDK2 多克隆抗体的制备
• 2.2.5 多克隆抗体的Western Blot 检测
• 3. 结果与讨论
• 3.1 PCR 法合成CDK2 多肽编码基因和pGEX-6P-1-CDK2 多肽重组质粒的成功构建
• 3.2 高纯度GST-CDK2 多肽融合蛋白质的获得
• 3.3 多克隆抗体的制备、纯化和特异性鉴定
• 4. 本章结论
• 第四章 Cyclin A-Cdk2 磷酸化仅含BH3 结构域蛋白质BMF 的研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料、仪器和溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 表达载体pGEX-6P-1-BMF 的构建
• 2.2.2 表达、纯化融合蛋白质GST-BMF
• 2.2.3 细胞培养和药物处理
• 2.2.4 免疫共沉淀
• 2.2.5 体外磷酸化实验
• 3. 结果与讨论
• 3.1 人源BMF 基因的获得和pGEX-6P-1-BMF 的成功构建
• 3.2 获得高纯度的GST-BMF 融合蛋白质
• 3.3 BMF 在体外磷酸化实验中不能被Cyclin A-Cdk2 磷酸化
• 4. 本章结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 作者简历