论文摘要
弹性蛋白酶（elastase）是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱肽链内切酶，广泛存在于哺乳动物及人的各种组织和体液中。弹性蛋白酶不仅能水解弹性蛋白，而且也可以水解其他蛋白质，如明胶、血红蛋白、白蛋白、血纤维蛋白等。因此广泛应用于医疗卫生、食品加工、日用化工及环境治理等行业，具有极大的经济价值和应用前景。目前国内主要从猪胰脏中提取，由于酶源受到限制，作为治疗用生化药物和其它方面的应用长期供不应求。 国外有关弹性蛋白酶的研究起步较早，并且初步建立了以微生物发酵方式生产弹性蛋白酶的工业技术体系。但是微生物发酵制备的弹性蛋白酶在生物安全性和毒性试验上却还不能令人满意。因此，作为治疗药物用的弹性蛋白酶仍然局限于从生物脏器中提取。鉴于以上原因，本研究利用基因工程技术，克隆了弹性蛋白酶基因，通过杆状病毒表达载体系统在昆虫细胞sf21中对其进行真核表达，初步探索出一条以培养细胞制备弹性蛋白酶的新路子。之所以采用杆状病毒表达载体系统，是因为它具有高的生物安全性，用杆状病毒表达载体系统生产的重组蛋白已获得包括美国FDA在内的广泛认可。此外，它在重组蛋白表达量和维持表达产物的天然生物活性方面具有较高的水平，是一种应用广泛的真核表达载体系统。 本研究以一产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，经PCR扩增得到1.5kb的弹性蛋白酶基因，测序后与GeneBank中的铜绿假单胞菌序列比对发现同源性100％。然后对PCR产物进行T-A克隆，获得质粒pMD18-Ela。将弹性蛋白酶基因切下，转入到载体pET28-a的6×His标签序列下游的多克隆位点获得中间载体pET28a-Ela。连同6×His序列一起将弹性蛋白酶基因克隆到杆状病毒表达载体系统的pBacPAK8转移载体，构建了重组载体pBacPAK8-His-Ela。同时，将绿色荧光蛋白基因直接克隆到pBacPAK8构建一对照载体pBacPAK8-GFP。用BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ和HindⅢ对pBacPAK8-His-Ela进行双酶切和单酶切验证，发现弹性蛋白酶及上游6×His序列正确插入到杆状病毒多角体启动子下。 采用脂质体介导法，将两个转移载体和亲本病毒一起共转染昆虫细胞系st21，72小时后在荧光显微镜下观察到对照实验组的细胞发绿色荧光，供试样品组的细胞也发生了明显的NPV感染症状和病变。回收细胞培养上清，空斑纯化获得了重组病毒BacPAK-Ela及BacPAK-GFP。以扩大培养后的重组病毒BacPAK-Ela感染sf21细胞，96小时后分离培养基和细胞层进行以下试验：提取感毒细胞DNA作为模板，对弹性蛋白酶基因cDNA进行PCR扩增，能够得到1.5kb条带；提取感毒细胞总蛋白进行SDS-PAGE实验，可以发现与弹性蛋白酶（33KDa）大小相近的34KDa条带。以弹性蛋白为底物的平板水解实验，发现感毒细胞裂解液能够水解其专一底物弹性蛋白，证实了外源基因产物具有一定的生物活性。以地衣红-弹性蛋白为底物，通过和攻毒后不同时间的细胞裂解液进行水解反应测定酶活，