大豆Gy3亚基cDNA的克隆及离子束介导其转化无芒雀麦的初步研究

论文摘要

根据Genbank（M36686）公布的大豆球蛋白基因Gy3亚基的cDNA序列设计并合成一对特异性引物，采用RT-PCR方法从优质大豆品种黑农37号中获得约1520bp大小的cDNA片段，将该片段克隆到pMD19-T载体中。经测序显示该片段含1523个核苷酸，与Genbank（M36686）公布的大豆球蛋白基因序列同源性为99％，证实本实验中克隆的cDNA序列为大豆球蛋白Gy3亚基基因。先提取重组质粒pMD19-T／Gy3，然后将重组质粒pMD19-T／Gy3经XbaⅠ、BamHⅠ双酶切的回收产物与植物表达载体pBI121经XbaⅠ、BamHⅠ双酶切的回收产物连接，从而构建了植物表达载体pBI121／Gy3。该表达载体含有β-Glucuraridase（GUS）报告基因和卡那霉素（kan）抗性基因，为以后转化体的筛选提供了方便，同时该载体的成功构建为今后利用大豆球蛋白Gy3亚基基因提高牧草等作物的营养品质奠定了基础。在对离子注入无芒雀麦种子引起的诱变效应的研究过程中发现，离子能量对种子存活率有一定的影响，并通过研究无芒雀麦种子的成活率和剂量的关系确定其转化剂量范围是800、900、1000×2.6×1013Ar+／cm2。对离子束介导质粒DNA转化无芒雀麦种子的实验体系进行了研究，发现无芒雀麦的干种子直接注入未能得到瞬间表达。而在谷运红博士论文中，拟南芥种子萌动24～48h后接受注入和转化，瞬间表达率约10％，本实验也对无芒雀麦种子做了类似的处理，确定其转化剂量范围是300、400、500×2.6×1013Ar+／cm2，却未能得到理想的结果。我们对冻害的防护问题进行研究并建立了离子注入愈伤组织的实验体系。在活体组织注入后可以存活的前提下，通过对离子束介导质粒DNA导入无芒雀麦愈伤组织遗传体系的研究，确定离子束介导无芒雀麦愈伤组织的转化剂量范围是2.6、5.2、7.8×1015Ar+／cm2，然后通过实际的转化实验确定最佳转化剂量5.2×1015Ar+／cm2，并将GUS基因和构建好的植物表达载体pBI121／Gy3转入了无芒雀麦的愈伤组织。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文符号缩写注释
• 第一章 引言
• 1.1 离子束生物技术的发展概况
• 1.1.1 离子束生物技术的兴起与发展
• 1.1.2 离子束生物技术在诱变育种上的应用
• 1.1.3 离子束生物技术在介导转基因上的应用
• 1.1.4 离子束生物技术的应用及展望
• 1.2 大豆蛋白质的组成结构及应用
• 1.2.1 大豆蛋白质的主要成分
• 1.2.2 11S大豆球蛋白结构及碱基同源性
• 1.2.3 大豆球蛋白基因在植物营养品质改良中的应用及展望
• 1.3 我国荒漠化地区的牧草选育
• 1.4 本文研究的意义和主要内容
• 第二章 大豆11S球蛋白Gy3（A1aB1b）cDNA的克隆及植物表达载体构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 试剂、质粒和菌株
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大豆的培育
• 2.3.2 大豆总RNA的提取、11S球蛋白Gy3亚基cDNA的克隆及序列分析
• 2.3.3 含目的基因Gy3亚基cDNA序列的植物表达载体构建
• 2.4 实验结果分析
• 2.4.1 大豆总RNA提取鉴定
• 2.4.2 RT-PCR产物的鉴定
• 2.4.3 Gy3亚基的cDNA序列与pMD19-T载体的连接鉴定
• 2.4.4 Gy3亚基的cDNA序列测序结果与Genbank（M36686）序列比对
• 2.4.5 目的片段和载体片段的回收
• 2.4.6 pBI121/Gy3表达载体阳性克隆的鉴定
• 2.5 讨论
• 第三章 离子束注入无芒雀麦种子和愈伤组织体系的建立
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 无芒雀麦种子的春化
• 3.3.2 离子束注入种子
• 3.3.3 种子培养方法
• 3.3.4 愈伤组织的诱导
• 3.3.5 不同甘油浓度对愈伤组织真空耐受性的影响
• 3.3.6 离子束注入愈伤组织
• 3.4 实验结果分析
• 3.4.1 离子注入干种子实验结果
• 3.4.2 离子注入春化种子实验结果
• 3.4.3 愈伤组织诱导实验结果
• 3.4.4 离子注入愈伤组织实验结果
• 3.5 讨论
• 第四章 离子束介导质粒 DNA转化无芒雀麦种子及愈伤组织的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 质粒的中量提取
• 4.3.2 GUS染色
• 4.3.3 干种子的转化处理
• 4.3.4 春化种子的转化处理
• 4.3.5 愈伤组织的转化处理
• 4.3.6 愈伤组织的抗生素敏感性实验
• 4.3.7 转化体的PCR检测
• 4.3.8 转化体的RT-PCR检测
• 4.4 实验结果分析
• 4.4.1 质粒中量提取结果
• 4.4.2 种子转化结果
• 4.4.3 质粒pBI121转化实验结果
• 4.4.4 质粒pBI121/Gy3转化实验结果
• 4.5 讨论
• 第五章 总结
• 参考文献
• 撰写的论文
• 致谢