抗Cyclin D1人源胞内单链抗体在肿瘤细胞中的表达及生物活性分析

论文摘要

细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是一类重要的细胞周期正性调控因子,它通过激活CDK4/6来推进细胞周期G1期到S期的演进。Cyclin D1在很多恶性肿瘤中呈过度表达,并与肿瘤的发生、恶性程度与患者的预后密切相关。Cyclin D1成为人们进行肿瘤基因治疗的靶点之一。 研究者们曾尝试向肿瘤细胞中注射抗Cyclin D1抗体、转录导入反义Cyclin D1,两种方法均可改变转化细胞形态,抑制肿瘤细胞增殖,但是由于存在免疫原性较强,后者又存在体内半衰期短、不稳定等缺点,限制了该法在肿瘤治疗中的应用。近年来兴起的以抗体作为效应分子的能够在细胞内高效、特异灭活靶蛋白的胞内抗体技术为肿瘤的基因治疗开辟了新的思路。 为此,本研究克隆了内质网滞留型抗人Cyclin D1胞内scFv基因（ER-ADx）,并构建其重组真核表达载体pER-ADx,通过细胞转染实验、RT-PCR、免疫组化、Dot-blot、MTT法生长增殖特性分析、流式细胞术等方法和技术分别对ER-ADx的表达及胞内定位情况、体外生物活性等进行了研究。结果表明,ER-ADx基因能够在肿瘤细胞中有效表达并实现胞内抗体的目标定位。ER-ADx基因的稳定表达能够显著抑制细胞生长和增殖,引起细胞周期阻滞,并明显诱导细胞凋亡。综上所述,以Cyclin D1为靶点的胞内抗体治疗作为一种新型肿瘤基因治疗方法,有潜在的应用价值。

论文目录

• 第一篇 引言
• 第一章 肿瘤的基因治疗
• 第一节 反义技术
• （一） 反义寡核苷酸
• （二） 反义RNA
• （三） 核酶
• 第二节 显性负突变技术
• （一） 细胞膜受体的显性负突变
• （二） 转录因子的显性负突变
• 第三节 RNA干扰技术
• （一） RNAi现象的发展及应用
• （二） RNAi技术的特点
• 第四节 胞内抗体技术
• （一） 胞内抗体技术的形成与发展
• （二） 胞内抗体技术的应用
• 第二章 细胞周期蛋白D1与肿瘤
• 第一节 Cyclin D的家族构成
• 第二节 Cyclin D1的表达及作用机制
• （一） Cyclin D1的表达
• （二） Cyclin D1的作用机制
• 第三节 Cyclin D1与肿瘤
• 第三章 本研究的立题目的与意义
• 第二篇 实验研究
• 第一章 实验材料
• （一） 株菌株、质粒和细胞
• （二） 引物设计
• （三） 主要试剂与溶液
• （四） 主要仪器
• （五） 计算机辅助工具
• 第二章 实验方法
• （一） 真核表达质粒pER-ADκ的构建
• （二） 表达质粒pER-ADκ的体外活性分析
• 第三章 实验结果
• 1. 表达质粒pER-ADκ的构建与鉴定
• 2.ER-ADk在肿瘤细胞中的表达分析
• 2.1 RT-PCR检测ER-ADκ的表达
• 2.2 ER-ADκ的胞内表达及定位分析
• 3 pER-ADk稳定转染的肿瘤细胞的鉴定
• 3.1 RT-PCR检测ER-ADκ的表达
• 3.2 间接免疫荧光实验分析.
• 3.3 Dot-blot分析
• 3.4 ER-ADκ抑制肿瘤细胞生长
• 3.5 ER-ADκ引起肿瘤细胞周期阻滞
• 3.6 ER-ADκ诱导肿瘤细胞凋亡
• 第四章 讨论
• （一） 肿瘤治疗靶点的选择
• （二） 内质网滞留型胞内抗体ER-ADκ的生物学活性
• 第五章 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢