马耳他型布氏杆菌弱毒疫苗株M5-90致弱分子机制的研究

论文摘要

布病尤其是由B. melitensis感染所致,仍然是目前世界上最重要的种人畜共患病,每年大约有50多万病例报道。迄今为止,采用多种方法开发和研究防控布病的疫苗,但是还没有种安全有效的疫苗能应用于人的布病防控,当前的主要疫苗均对人有定致病性。B. melitensis M5-90系我国自行分离培养的弱毒疫苗株,具有较好的安全性及免疫保护力,为我国布病防控发挥了重要作用,但其致弱的分子机制还不甚清楚。为研制更加安全、有效的布氏杆菌疫苗,迫切需要加强对布氏杆菌病病原致病分子机制与免疫机制的基础研究。I.马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90致弱分子机制的研究在完成M5-90及其亲本强毒株M28的全基因组测序基础上,通过系统基因组比对,并结合比对亲缘关系最近的强毒国际参考株B. melitensis 16M和ATCC23457,共筛选到23个毒力相关基因（OCDs）。其中差异最显著的是延伸因子EF-Tu（BM28A1261）,在M5-90编码区出现50处SNPs和9处Indels,占整个基因组差异的30%。2-D DIGE分析实验室条件下培养的M28和M5-90全细菌蛋白（pH范围4.0-7.0）表达差异,共鉴定到24个差异显著蛋白,7个为M5-90高表达,其余17个为M28高表达。这是第次关于人工致弱的强、弱亲本毒株间基因组学和比较蛋白组学分析。结果发现, DNA/RNA合成代谢,营养吸收利用和细胞外膜合成或外膜蛋白等相关基因变异在M5-90的致弱过程中起到了重要作用。在此基础上,首先选择基因组上突变最为集中的tuf-2（BM28A1261）基因作为重组靶位点,以M28和M5-90为亲本,以卡那霉素抗性基因（Kanr）作为筛选标记,构建tuf基因缺失突变株;成功构建了突变株M28-tuf1、M28-tuf2和M90-tuf2。M90-tuf2和亲本株M5-90不论在生长特性还是对小鼠毒力上都无显著差异;M28-tuf1、M28-tuf2对小鼠致病力明显减弱（p<0.01）,但仍比疫苗株强（p<0.01）。M28-tuf1致病力略高于M28-tuf2,差异不显著;通过小鼠感染模型证实tuf是M5-90致弱的重要基因,但不是唯因素,tuf-2在M5-90致弱中的起到重要作用。II.马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90致弱免疫机制研究布氏杆菌是种胞内寄生菌,巨噬细胞是布氏杆菌体内侵袭的主要目标细胞。M5-90及其强毒亲本株M28致病力显著差异,研究二者与宿主相互作用差异,有助于与理解M5-90致弱的免疫机制。本研究,利用数字表达谱DGE技术分析鼠腹膜巨噬细胞感染M28和M5-90 4 h后转录组的变化,共计鉴定出1019个DEGs。发现多个显著性差异信号通路,如溶酶体和SNARE胞内运输通路。首次分析了强弱毒布氏杆菌感染组间DEGs,并对显著性差异代谢通路DEGs构建蛋白相互作用网络（Singal-Net）。网络中关键基因多为细胞凋亡相关基因,如Mapk3、Traf6、Chuk、Kras、Jak1和Ptpn6等。这些基因及其参与的信号转导过程体现了强弱菌株侵染宿主细胞的主要差别,其结果是弱毒株M5-90抗溶酶体消化及抗细胞凋亡能力弱于强毒株M28,导致宿主细胞内生存能力的下降或存活时间的缩短。这些数据有利于深入理解M5-90的致弱分子免疫机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 布氏杆菌病概况
• 1.3 布氏杆菌病原学特征
• 1.3.1 布氏杆菌形态学
• 1.3.2 布氏杆菌分类
• 1.4 布氏杆菌胞内生存机制
• 1.4.1 布氏杆菌对细胞的侵袭作用
• 1.4.2 布氏杆菌的胞内运输
• 1.4.3 布氏杆菌的胞内复制
• 1.5 布氏杆菌致病机制
• 1.5.1 脂多糖/O-多聚糖
• 1.5.2 IV 型分泌系统
• 1.5.3 BvrR-bvrS 基因调控系统
• 1.5.4 其它毒力相关因子
• 1.6 布氏杆菌基因组学
• 1.6.1 布氏杆菌基因组特征
• 1.6.2 布氏杆菌比较基因组学
• 1.7 布氏杆菌蛋白组学
• 1.7.1 早期布氏杆菌蛋白研究
• 1.7.2 布氏杆菌2-DE 蛋白组学研究
• 1.7.3 布氏杆菌比较蛋白组学研究
• 1.8 本研究的目的意义
• 第二章 疫苗株M5-90 及其强毒亲本株M28 比较基因组和比较蛋白组分析
• 2.1 实验材料和方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂及仪器
• 2.1.3 细菌基因组提取
• 2.1.4 全基因组测序
• 2.1.5 基因预测和注释
• 2.1.6 基因组比较和系统进化分析
• 2.1.7 单核苷酸多态性（SNPs） 分析
• 2.1.8 插入缺失序列（Indels）分析
• 2.1.9 布氏杆菌蛋白组学分析
• 2.1.10 实时荧光定量PCR（qPCR）分析
• 2.2 结果和讨论
• 2.2.1 B. melitensis M5-90 和M28 基因组特征
• 2.2.2 全基因组比对
• 2.2.2 单核苷酸多态性（SNPs）分析
• 2.2.3 系统进化分析
• 2.2.4 毒力候选基因筛选
• 2.2.5 毒力候选基因（OCDs）分析
• 2.2.6 M28 和M5-90 2D-DIGE 分析
• 2.2.7 qPCR 分析
• 2.3 小结
• 第三章 马耳他布氏杆菌疫苗株M5-90 致弱相关基因耐热延伸因子EF-TU 研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 自杀质粒同源臂tuf 基因外侧序列基因扩增及序列测定
• 3.1.3 含有外源基因自杀质粒pSP-tuf-k 的构建
• 3.1.4 突变株构建、筛选及卡那霉素基因表达稳定性的检测
• 3.1.5 突变菌株生化特性及生长曲线测定
• 3.1.6 EF-Tu 克隆表达
• 3.1.7 EF-Tu 免疫小鼠免疫保护实验
• 3.1.8 小鼠体内感染实验
• 3.2 结果
• 3.2.1 pSP-tuf-k 转移载体构建及鉴定
• 3.2.2 重组蛋白EF-Tu 克隆纯化
• 3.2.3 EF-Tu 蛋白免疫原性分析
• 3.2.4 重组蛋白tuf-iELISA 检测
• 3.2.5 突变菌株抗性筛选及PCR 鉴定
• 3.2.6 突变株生物学特性
• 3.2.7 突变菌株小鼠体内毒力的测定
• 3.3 讨论
• 第四章 感染M28 和M5-90 鼠巨噬细胞转录组DGE 分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验动物及相关设施
• 4.1.3 主要试剂和仪器
• 4.1.4 原代鼠腹膜巨噬细胞培养
• 4.1.5 巨噬细胞感染和总RNA 提取
• 4.1.6 数字表达谱（DGE）分析
• 4.1.7 DEGs 筛选
• 4.1.8 DEGs 聚类分析
• 4.1.9 DEGs GO 功能富集分析
• 4.1.10 DEGs Pathway 显著性富集分析
• 4.1.11 蛋白互作网络分析
• 4.1.12 巨噬细胞2-D DIGE 分析
• 4.1.13 qPCR 分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 DGE 数据分析
• 4.2.2 基因表达注释
• 4.2.3 DEGs 筛选
• 4.2.4 DEGs Pathway 显著性富集分析
• 4.2.5 DEGs 蛋白互作网络分析
• 4.2.6 巨噬细胞蛋白组学分析
• 4.2.7 qPCR 分析
• 4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历