天蓝色链霉菌cslA基因的研究

论文摘要

纤维素合成酶及纤维素合成酶类似蛋白在生物中广泛存在,在细菌、真菌、植物及低等动物中发挥了重要作用;它们的合成产物β1-4葡聚糖是某些细菌生物膜（biofilm）主要成分之一,也是植物细胞壁的主要成分,同时纤维素合成酶及纤维素合成酶类似蛋白在细菌生物膜形成和植物组织器官发育过程中也有重要的作用。我们发现在链霉菌的基因组中也存在一个类似的编码基因,本研究对该基因在链霉菌的功能做了分析。该基因是链霉菌科斯文库质粒SCE20上的第10个ORF,经生物信息学的初步分析发现该基因的编码产物是一个糖基转移酶,与其它已知的纤维素合成酶的序列比较发现纤维素合成酶中保守的主要模体也存在于该糖基转移酶中。因此,我们把该基因命名为cslA基因。为了进一步研究该基因在链霉菌中的功能,我们对该基因进行了中断实验,实验观察结果表明该基因对链霉菌气生菌丝的发育具有重要的作用,中断菌株表现出产孢严重延迟。透射电子显微镜分析发现中断菌株的细胞壁和横膈有缺陷,孢子的形态也变得不规则;扫描电子显微镜观察发现中断菌株的气生菌丝有多分支的现象。荧光增白剂calcofluor染色实验结果表明,CslA蛋白在菌丝的顶端合成产物并且产物中含有β1-4糖苷键。绿色荧光蛋白的融合定位表明CslA蛋白在基质菌丝和气生菌丝中都能检测到表达而且蛋白主要是位于菌丝的生长顶端。细菌双杂交实验表明该蛋白与细菌骨架蛋白DivIVAsc有相互作用。胞外提取的Chaplins和Rodlins能够促进中断菌株产生气生菌丝,但是一系列的疏水蛋白报告系统检查结果表明疏水蛋白在中断菌株中都正常的表达。这些实验结果显示cslA基因是链霉菌形态分化和发育的一个重要基因,对它的研究有助我们理解细胞的发育过程。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 文献综述
• 1.1 链霉菌及其基础研究模式菌株天蓝色链霉菌A3（2）的概述
• 1.2 链霉菌的形态分化发育
• 1.2.1 应对生长环境的改变
• 1.2.2 基质菌丝的程序性死亡
• 1.2.3 次生代谢开始活跃
• 1.2.4 转换菌丝的分支模式
• 1.2.5 转换菌丝的细胞分裂模式
• 1.2.6 天蓝色链霉菌A3（2）的一种信号级联系统
• 1.3 纤维素合成酶及纤维素合成酶类似蛋白
• 1.3.1 细菌中纤维素合成酶及纤维素合成的调控
• 1.3.2 植物中纤维素合成酶及纤维素合成的调控
• 1.4 本课题的工作基础、目的和意义
• 2 实验方法与材料
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 质粒与引物
• 2.2 培养基与化学试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 链霉菌菌种培养及保存
• 2.3.2 大肠杆菌质粒抽提
• 2.3.3 大肠杆菌质粒的快速抽提检测
• 2.3.4 链霉菌总DNA的少量快速抽提
• 2.3.5 除去DNA溶液中的蛋白质和RNA杂质
• 2.3.6 DNA片段的纯化和回收
• 2.3.7 DNA片段的去磷酸化
• 2.3.8 DNA片段之间的连接
• 2.3.9 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA的转化
• 2.3.10 A-T克隆
• 2.3.11 在大肠杆菌中用IPTG诱导重组蛋白的表达
• 2.3.12 常规PCR技术
• 2.3.13 大肠杆菌和链霉菌之间的跨属DNA转移
• 2.3.14 地高辛标记的DAN杂交
• 2.3.15 显微镜观察
• 2.3.16 链霉菌总RNA的抽提
• 2.3.17 RNA中DNA杂质的去除
• 2.3.18 RNA的定量以及质量检测
• 2.3.19 链霉菌总蛋白提取
• 2.3.20 SDS-PAGE
• 2.3.21 细菌双杂交检测蛋白质互作
• 3 结果与分析
• 3.1 链霉菌中纤维素合成酶类似基因的生物信息学分析
• 3.1.1 链霉菌中纤维素合成酶类似蛋白
• 3.1.2 链霉菌中纤维素合成操纵子
• 3.1.3 小结
• 3.2 链霉菌纤维素合成酶类似基因中断菌株的构建
• 3.2.1 中断载体的构建
• 3.2.2 筛选突变体及Southern杂交验证
• 3.2.3 突变体的表型观察
• 3.2.4 突变体互补载体的构建
• 3.2.5 突变体互补的表型观察
• 3.2.6 小结
• 3.3 中断菌株表现出表型多样性
• 3.3.1 基因中断菌株更易片段化
• 3.3.2 透射电镜观察
• 3.3.3 孢子丝普通光学观察
• 3.3.4 扫描电镜观察
• 3.3.5 孢子P.I染色
• 3.3.6 静置培养
• 3.3.7 小结
• SC基因的功能初步分析'>3.4 CSLA_SC基因的功能初步分析
• 3.4.1 Calcofluor染色
• 3.4.2 cslA基因RT-PCR检测
• 3.4.3 CslA基因3'端绿色荧光蛋白基因融合载体的构建
• 3.4.4 CslA基因3'端绿色荧光蛋白基因融合的观察结果
• 3.4.5 CslA基因5'端绿色荧光蛋白基因融合载体的构建
• 3.4.6 CslA基因5'端绿色荧光蛋白基因融合的观察结果
• 3.4.7 小结
• 3.5 与细胞骨架蛋白DIVIVA的关系
• 3.5.1 DivIVA绿色荧光融合载体的构建
• 3.5.2 DivIVA绿色荧光融合载体对菌株的影响
• 3.5.3 DivIVA绿色荧光融合观察结果
• 3.5.4 DivIVA与CslA细菌双杂交互作载体的构建
• 3.5.5 DivIVA与CslA细菌双杂交互作观察结果
• 3.5.6 小结
• 3.6 与疏水蛋白的关系
• 3.6.1 Chapins和Rodlins疏水蛋白的提取
• 3.6.2 孢外互补XE突变体
• 3.6.3 用EGFP报告系统检测chaplins和rodlins的表达
• 3.6.4 EGFP观察结果
• 3.6.5 ramP1启动子绿色荧光报告载体的构建
• 3.6.6 ramP1启动子绿色荧光报告的结果观察
• 3.6.7 SapB小肽的提取
• 3.6.8 XE与光秃菌株的胞外型号互补
• 3.6.9 小结
• 3.7 SCM10.16 ORF的中断
• 3.7.1 SCM10.16 ORF的中断载体的构建
• 3.7.2 SCM10.16ORF的中断
• 3.8 链霉菌一种特殊形态分化形成的初步条件摸索
• 4 讨论与展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录（作者简介）
• 一、基本情况
• 二、学习和工作经历及获学位情况