论文摘要
目的：破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞,由造血系统的单核-巨噬细胞系分化而来,在生理和病理性骨代谢中发挥着重要的作用。许多疾病状态下,破骨细胞的形成和功能受到影响,导致骨吸收异常的病理状态。体内破骨细胞分化是一个复杂的过程,其机制尚未完全明了。以刺激因子体外诱导骨髓单核细胞向破骨细胞分化是研究破骨细胞分化机制的有效方法,本实验分离培养原代小鼠骨髓单核细胞,并以不同浓度刺激因子诱导,建立后续试验应用的小鼠原代骨髓单核细胞（BMMs）体外培养体系。方法：取小鼠原代全骨髓细胞,在含有50ng/ml M-CSF的骨髓单核细胞培养基中37℃孵箱内培养24h,利用差异贴壁方法去除骨髓基质细胞,取未贴壁的细胞悬液,再利用单核细胞分离液分离出纯度较高的骨髓单核细胞。以不同浓度RANKL体外诱导单核细胞向破骨细胞分化,于不同时间点观察各组细胞分化状态,培养72h时终止诱导,行TRAP染色,观察比较诱导终点时不同浓度RANKL诱导组破骨细胞分化程度及破骨细胞计数。结果：分离所得骨髓单核细胞呈贴壁生长,均匀分布,形态较为均一,多为圆形、多角形,少数为长梭形,细胞体积较小。本实验采用50ng/ml M-CSF及两种浓度小鼠重组RANKL分别诱导:1ng/ml和lOng/ml。结果显示,在诱导早期（24h）,两组细胞生长状态大致相同,形态较为均一,细胞多为圆形及多角形,少量单核细胞呈TRAP染色阳性,均未见多核细胞生成。两组细胞均于诱导48h开始出现体积较小的TRAP阳性多核细胞,形态、体积及数目无明显差异。直至诱导晚期（72h）,两组细胞分化状态才出现区别：10ng/mlRANKL刺激组TRAP阳性多核细胞数量更多、体积更大,胞浆更为伸展；而1ng/mlRANKL刺激组TRAP阳性多核细胞体积则比较小,形状多为毛刺状或油烈蛋样。结论：M-CSF的作用下全骨髓细胞于37℃孵箱内培养24小时,此时收集未贴壁细胞,是利用BMMs在M-CSF作用下贴壁时间长于骨髓基质细胞而进行的第一次纯化,将收集的未贴壁细胞经过单核细胞分离液梯度离心半小时,根据不同细胞密度的差异,取中间部分白膜层进行单核细胞第二次纯化,用此方法便可以分离出形态较为均一、纯度较高的骨髓单核细胞,可用于后续试验。在50ng/mlM-CSF条件下,高浓度（10ng/ml）RANKL较低浓度（1ng/ml）RANKL刺激组诱导破骨细胞生成能力更强,可以增加破骨细胞生成的数量、体积,并可能提高其骨吸收能力,但是并不能加快诱导破骨细胞生成的速度。后续试验可选用1ng/ml RANKL及50ng/ml M-CSF体外诱导破骨细胞分化。目的：骨稳态一旦被破坏,便会导致多种疾病的发生。骨吸收功能亢进可导致骨质破坏,骨密度降低,如类风湿性关节炎、自身免疫性关节炎、骨质疏松等,这些疾病大多伴随有血清或骨关节局部肿瘤坏死因子（TNF-a）的增高。高水平TNF-α)与全身或局部性骨丢失疾病的发生有着密切的关系,可直接或间接的促进破骨细胞的生成及功能,但其具体作用机制尚未完全阐明。近年来体外研究证明,TNF-α不直接影响RANK/RANKL近端激活的分子,而是可能通过活化破骨前体细胞内钙离子震荡,增强NFATc1自放大作用来促进RANKL诱导的破骨细胞生成。体内参与该震荡调控的分子众多,TNF-α是通过何种机制实现其对钙离子震荡的调控作用呢?以往文献报道,ROS和PC-PLC是细胞内位于多种TNF-α信号通路下游同时参与介导钙振荡形成的两种重要信号分子,介导了细胞凋亡、炎症反应等多种细胞事件的发生。IP3受体是存在于内质网膜的一种钙离子通道,通过结合IP3而活化,介导内质网钙库和细胞质之间的钙离子交通,是细胞内钙震荡波形成的重要通道。至今研究发现主要存在3种IP3受体亚型：IP3R1、IP3R2和IP3R3,其分布有组织和细胞类型特异性。研究显示,小鼠破骨前体细胞中同时存在上述三种IP3受体。本部分实验旨在探讨ROS、PC-PLC及IP3Rs在TNF-a对钙离子震荡调控过程中的作用,进一步揭示TNF-α促进体内外破骨细胞生成的机制。方法：本研究采用第一部分实验中建立的破骨细胞体外培养体系,以1ng/ml RANKL和50ng/ml M-CSF诱导小鼠骨髓来源单核细胞,在诱导过程中加入3ng/ml TNF-α刺激。使用DCFH-CA荧光探针检测细胞内不同诱导时间点ROS水平变化,明确ROS在RANKL诱导破骨细胞分化过程中的变化趋势及加入TNF-α刺激后细胞内ROS的变化情况；采用磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）特异性抑制剂D609探讨PC-PLC在TNF-α促进体外诱导破骨细胞生成中的作用。将培养细胞分为诱导对照组、TNF-α刺激组、D609刺激组及TNF-a+D609刺激组四组,施加不同诱导及刺激因子。于培养48h时,激光共聚焦显微镜检测各刺激组细胞内钙离子的震荡情况,明确各刺激因素对钙振荡的影响效果；RT-PCR及western blotting检测不同处理组三种IP3Rs mRNA及蛋白表达水平,进一步阐述IP3Rs在TNF-α促进RANKL体外诱导破骨细胞生成过程中的作用。结果：研究中发现,细胞内ROS水平在RANKL诱导24h开始升高,并持续至48h以后,加入TNF-a不能使细胞内ROS进一步升高；比较各组TRAP染色阳性多核细胞数发现,磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）特异性抑制剂D609抑制了TNF-α对破骨细胞生成的促进作用,但是对RANKL单独诱导的破骨细胞生成并无抑制,相反轻度促进破骨细胞生成。TNF-α能够明显增强小鼠骨髓来源单核细胞中钙离子通道IP3R1mRNA和蛋白的表达,而不影响IP3R2和IP3R3mRNA水平,提示位于内质网膜上的钙离子通道IP3R1的上调可能为其配体IP3提供更多的结合位点,促进细胞内钙震荡的产生,IP3R1参与TNF-a对RANKL体外诱导破骨细胞生成的促进作用,而IP3R2和IP3R3可能并不参与介导该过程。D609抑制了TNF-a对IP3R1mRNA和蛋白表达的促进作用,降低钙离子震荡水平,进而抑制NFATc1活化,同时消除了TNF-α对破骨细胞生成的影响。上述结果表明PC-PLC及IP3R1可能参与TNF-α促进破骨细胞生成的过程之中。结论：本实验结果进一步验证了TNF-α不直接影响RANK/RANKL近端激活的分子,ROS可能介导破骨细胞体外分化,但不参与TNF-α对RANKL诱导破骨细胞生成的促进作用；TNF-α能够通过活化PC-PLC,上调IP3R1mRNA和蛋白的表达水平,促进破骨前体细胞内钙库与细胞浆之间的钙交通,以增强其钙离子震荡,促进NFATc1活化和自放大,最终促进RANKL诱导的破骨细胞生成。