论文题目: 玉米磷脂酰肌醇代谢途径中酶的基因克隆及其功能鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 细胞生物学
作者: 翟淑梅
导师: 张举仁
关键词: 玉米,抗逆性,转基因烟草
文献来源: 山东大学
发表年度: 2005
论文摘要: 一些工作表明,磷酸肌醇信号途径在高等植物的生长、发育及对环境胁迫反应中发挥重要作用。磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PtdIns）是真核细胞中的主要磷脂之一,是细胞中主要的磷脂信号分子的前体。磷脂酰肌醇合成酶（phosphatidylinositol synthase,PIS）以CDP-DG和myo-inositol为底物合成PtdIns,PtdIns以不同方式被磷酸化产生一系列的磷酸肌醇,其中磷脂酰肌醇—4,5—二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-biphosphate,PIP2）可被磷脂酶C（phospholipase C,PLC）水解产生二酯酰甘油（diacylglycerol,DG）和三磷酸肌醇（trisphosphate inositol,IP3）。在动物细胞中IP3刺激细胞内Ca2+的释放,而DG则激活蛋白激酶K（PKC）的活性。与动物系统相比,我们对植物中磷酸肌醇信号途径还不是很了解,目前的工作仅限于相关基因的克隆及功能分析。 玉米（Zea mays L.）是重要的粮食兼饲料作物,产量居世界各种作物之首。克隆玉米重要农艺性状相关基因并且研究其结构和功能,对于阐明植物遗传和发育的分子机制以及禾谷类作物之间的进化关系具有重要意义。本工作首次从玉米中克隆到了分别编码玉米PIS和PI-PLC基因的cDNA序列并进行了功能分析。 玉米磷脂酰肌醇合成酶基因的克隆和功能鉴定 以0.8%（W/V）NaCl处理24小时的玉米黄化苗为材料,构建cDNA文库。选水稻OsPIS基因和拟南芥AtPIS基因的核苷酸序列在GenBank中进行检索得到具有PIS保守序列的玉米EST序列,根据后者设计引物PISF1:5’-TCA TTG CAT TTG CGG TTT GCT ATT C-3’和PISR1:5’-ATG CTT CAT TTG CTG CGC TTC-3’。采用RT-PCR方法得到约0.6kb的DNA片段,测序分析表明该片段含有PIS的保守序列,因此以PISF1和PISR1为引物,采用PCR方法筛选玉米cDNA文库。从cDNA文库中克隆到一个可能编码磷脂酰肌醇合成酶的cDNA序列（命名为ZmPIS）。序列分析表明,该cDNA序列全长1164bp,包含一个648个核苷酸的编码框。推测其编码一个由215个氨基酸组成的蛋白质,计算得其分子量和等电点分别为24kDa和8.79。其起始密码子上游第122-124核苷酸编码一个终止密码子,显示该cDNA序列包含全长ZmPIS编码区。基因组Southern杂交分析表明,ZmPIS基因在玉米中可能有两个拷贝。ZmPIS与其它PIS在核苷酸及氨
论文目录:
中文摘要
Abstract
符号说明
第一章 前言
1.1 肌醇磷脂信号系统简介
1.2 磷脂酰肌醇合成酶研究进展
1.2.1 酵母中的磷脂酰肌醇合成酶
1.2.2 哺乳动物组织中的磷脂酰肌醇合成酶
1.2.3 植物中的PIS
1.3 磷脂酶C研究进展
1.3.1 PI-PLC的类型、结构及活性调节
1.3.2 植物PI-PLC研究进展
1.4 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 植物材料和菌株及质粒
2.2 实验方法
2.2.1 玉米总RNA的提取
2.2.2 mRNA的分离
2.2.3 玉米cDNA文库构建
2.2.4 编码玉米PIS及PLC基因的cDNA片段的分离
2.2.5 玉米cDNA文库筛选
2.2.6 Southern blot分析
2.2.7 Northern blot分析
2.2.8 胁迫条件下PIS、PLC转录水平变化的检测
2.2.9 酵母突变体功能互补分析
第三章 结果与分析
3.1 玉米cDNA文库的构建
3.1.1 酸酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法从玉米黄化叶片中制备总RNA
3.1.2 玉米cDNA文库的滴度、重组率及插入cDNA片段的长度
3.2 玉米PIS基因的克隆及功能分析
3.2.1 玉米PIS基因cDNA片段的分离
3.2.2 玉米cDNA文库的筛选及ZmPIS基因的克隆
3.2.3 ZmPIS基因的Southern blot分析
3.2.4 ZmPIS基因的Northern blot分析及其在胁迫条件下转录水平的变化
3.2.5 酵母突变体互补实验
3.2.6 转ZmPIS基因烟草植株的获得
3.2.7 转ZmPIS基因烟草植株的耐旱性分析
3.2.8 转ZmPIS基因烟草植株的耐盐性分析
3.3 玉米PLC基因的克隆及功能分析
3.3.1 玉米PLC基因cDNA片段的分离
3.3.2 玉米ZmPLC基因的克隆
3.3.3 ZmPLC基因的Southern blot分析
3.3.4 ZmPLC基因在玉米植株中的表达分析
3.3.5 ZmPLC互补酵母plcl突变体的功能分析
3.3.6 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和抗体制备
3.3.7 转ZmPLC基因烟草植株的获得
3.3.8 转ZmPLC基因烟草植株的抗逆性分析
第四章 讨论
4.1 ZmPIS和ZmPLC基因的克隆和验证
4.2 ZmPIS和ZmPLC基因原核表达及表达蛋白的纯化
4.3 ZmPIS和ZmPLC基因对逆境条件的响应
4.4 转基因烟草的抗逆性分析
附录
附录1 ZmPIS的核苷酸序列和推测的氨基酸序列
附录2 ZmPLC的核苷酸序列和推测的氨基酸序列
参考文献
致谢
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发布时间: 2006-05-30
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