抑制Hedgehog信号通路对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖及凋亡的影响

论文摘要

皮肤鳞状细胞癌（Squamous cell carcinoma,SCC）的发病率有逐年增高趋势,但其病因及具体发病机制尚未完全阐明,近年的资料表明可能与下列因素有关:1、紫外线辐射;2、人乳头瘤病毒（HPV）;3、化学致癌物质的接触;4、癌前期皮肤病及免疫抑制剂的应用;5、其他皮肤病:慢性溃疡、烧伤或外伤性瘢痕等;6、热损伤。目前SCC的治疗多为非特异性疗法,并不针对肿瘤自身的发病特点,所以不良反应较常见。因此,开发新型的、针对肿瘤特定发病机制的治疗更具前景,也引起国内外皮肤界学者的广泛关注。Hedgehog（Hh）信号通路是近年来倍受关注的一个调控胚胎发育的信号转导途径。研究表明,Hh信号通路在基底细胞癌（Basal cell carcinoma,BCC）等多种肿瘤的发病及治疗中起着重要作用。Cyclopamine（环杷明）是Hh通路的特异性抑制剂,它可以特异性抑制该通路的活性,已成为一种潜在的抗肿瘤药物。既往研究和我们的初步工作发现SCC的发生、发展与Hh通路的异常激活有关。为进一步明确Hh信号通路在SCC发病和治疗中的作用,本课题以五种人SCC细胞系为研究对象,体外观察cyclopamine特异性抑制Hh信号通路对SCC细胞增殖、凋亡及其细胞周期的影响。目的:探讨cyclopamine特异性抑制Hedgehog信号转导通路对人SCC细胞增殖及凋亡的影响。方法:体外培养五种人SCC细胞株,经cyclopamine处理后,分别采用MTT法测定cyclopamine对SCC细胞增殖的抑制作用,光镜下观察细胞形态变化,采用流式细胞仪PI染色法检测cyclopamine对SCC细胞周期分布的影响,并用流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双重标记法检测细胞凋亡的变化。结果:1、Cyclopamine抑制Hh通路对SCC细胞的形态学影响体外常规培养五种鳞癌细胞系A431、Sa3、HSQ-89、Tca、HSC-2,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长情况。五种细胞均呈贴壁生长,镜下观察结果显示:空白对照组和阴性对照组的细胞形态规则,轮廓清晰;与对照组细胞形态比较,cyclopamine组细胞生长缓慢,立体感消失,细胞内颗粒增多,胞质皱缩,核固缩现象明显,细胞变小变圆,轮廓变模糊。形态学结果表明cyclopamine作用后的各SCC细胞系生长受到抑制,形态受损。2、Cyclopamine对SCC细胞增殖的抑制作用MTT比色法检测不同浓度（依次为:0.5、1、2、5μmol/L）cyclopamine对鳞癌细胞生长的剂量效应影响,结果表明cyclopamine能剂量依赖性地抑制五种鳞癌细胞的生长,其中以5μM浓度时抑制作用最为明显。选取5μM cyclopamine作用于培养的细胞5～8天,检测其抑制鳞癌细胞生长的时间效应。结果表明cyclopamine对各SCC细胞系的增殖抑制也具有时间依赖性。3、Cyclopamine对SCC细胞的凋亡诱导作用选取5μM cyclopamine作用于SCC细胞48h,采用Annexin-V-FITC/PI双重染色,流式细胞仪检测凋亡率的变化。结果显示,除HSQ-89细胞的凋亡率未检测到明显改变外,cyclopamine组的A431、Sa3、Tca、HSC-2四种细胞凋亡率（早期+晚期凋亡率）均较空白对照组明显增加（P<0.05）。结果表明cyclopamine能够明显诱导SCC细胞发生凋亡,对不同的SCC细胞系,其凋亡诱导作用不同。4、Cyclopamine对SCC细胞的周期阻滞作用5μM cyclopamine作用于SCC细胞48h,PI染色后流式细胞仪检测cyclopamine对SCC细胞周期分布的影响。结果显示:Tca细胞的实验组G2/M期细胞较空白对照组明显增多,A431、Sa3、HSC-2三种细胞的实验组G0/G1期细胞较空白对照组明显增多,G1期前出现较对照组更为明显的亚二倍体峰;HSQ-89的细胞实验组与对照组未检测到明显差别。结果表明:Cyclopamine抑制Hh通路能够影响SCC细胞的正常周期活动,它可诱导Tca细胞发生G2/M期阻滞,诱导A431、Sa3、HSC-2细胞发生G0/G1期阻滞。结论:Hedgehog信号通路的特异性抑制剂cyclopamine能够有效抑制SCC细胞的增殖,诱导细胞凋亡,诱导细胞发生特定细胞周期的阻滞为其可能机制之一。该结果为进一步深入研究SCC的发病机制及探索新的治疗方法提供了一定的理论依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 0 引言
• 实验一 Cyclopamine 对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的影响
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 实验二 Cyclopamine 对人皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 实验三 Cyclopamine 对人皮肤鳞状细胞癌细胞周期的影响
• 1 材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢