鲫鱼免疫球蛋白基因的鉴定、应答和功能研究

论文摘要

本研究在鲫鱼中分离鉴定了5类免疫球蛋白基因,包括IgM基因、IgZ基因和嵌合型的IgMZ1、IgMZ2及IgZ2基因。除了IgZ2基因只分离出分泌型外,其他基因都具有分泌型和膜型两种存在形式。对这些基因序列和分子结构进行系统分析后发现鲫鱼IgZ基因也具有与斑马鱼IgZ类似的结构特点,不同的是,鲫鱼IgZ还能以“分子间”嵌合（IgMZ1和IgMZ2）和“分子内”嵌合（IgZ2）的形式存在;同时在IgM分子中还可能存在类铰链区和补体位点。进一步对嵌合基因形成机制进行研究,发现IgZ类嵌合基因的形成可能发生在DNA水平。IgZ作为一类在硬骨鱼中新发现的抗体类型,其应答方式还未有深入研究。因此,本研究选取典型的胸腺依赖性抗原BSA和胸腺非依赖型抗原LPS以及致病菌嗜水性气单胞菌（Aeromonas hydrophila）免疫鲫鱼,分别研究了IgM、IgZ和IgMZ1在不同刺激条件下脾脏、头肾和外周血中的基因表达变化及在血清、体表和肠道的应答规律。结果显示IgMZ和IgZ主要在体表和肠道等黏膜系统发挥免疫作用,而IgM则在不同器官和组织中都广泛存在,尤其在血清中是主要的抗体类型。本研究还首次在鲫鱼外周血中鉴定出IgM+、IgZ+和IgM+/IgZ+等不同标记的B淋巴细胞。进一步的研究发现淋巴细胞表面的IgM可能与淋巴细胞的吞噬作用有关,而IgZ则不然,表明不同标记的淋巴细胞可能具有不同的功能。结合以上的研究结果,本研究还对鲫鱼等硬骨鱼类及其他物种中的免疫球蛋白基因进行了进化分析,发现硬骨鱼IgZ类基因可能与哺乳动物IgA有一定的进化关系,并提出了免疫球蛋白基因起源与进化的假说。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 免疫球蛋白概述
• 1.1.1 免疫球蛋白的结构和功能
• 1.1.1.1 免疫球蛋白的基本结构
• 1.1.1.2 免疫球蛋白的生物学功能
• 1.1.2 免疫球蛋白的基因及其表达
• 1.1.2.1 免疫球蛋白的基因结构
• 1.1.2.2 免疫球蛋白的基因重排
• 1.1.2.3 免疫球蛋白的类别转换
• 1.1.3 免疫球蛋白的应答
• 1.2 鱼类及其它物种的免疫球蛋白
• 1.2.1 高等动物的免疫球蛋白
• 1.2.1.1 哺乳动物
• 1.2.1.2 鸟类
• 1.2.1.3 两栖动物
• 1.2.2 鱼类的免疫球蛋白
• 1.2.2.1 软骨鱼类
• 1.2.2.2 硬骨鱼类
• 1.2.3 免疫球蛋白基因的进化
• 2 实验研究
• 2.1 鲫鱼免疫球蛋白基因的分子克隆与分析
• 2.1.1 鲫鱼免疫球蛋白的分子克隆
• 2.1.1.1 实验材料与方法
• 2.1.1.1.1 实验材料与试剂
• 2.1.1.1.2 总RNA的抽提
• 2.1.1.1.3 cDNA第一链的合成
• 2.1.1.1.4 免疫球蛋白分子的克隆
• 2.1.1.1.5 T-A克隆
• 2.1.1.1.6 测序
• 2.1.1.2 实验结果
• 2.1.1.2.1 IgZ的分子克隆
• 2.1.1.2.2 IgM的分子克隆
• 2.1.2 鲫鱼免疫球蛋白基因的序列与结构分析
• 2.1.2.1 实验材料与方法
• 2.1.2.1.1 Ig基因序列特征的分子生物学分析
• 2.1.2.1.2 Ig基因序列的生物信息学分析
• 2.1.2.2 实验结果
• 2.1.2.2.1 鲫鱼IgZ基因嵌合重组现象的鉴定
• 2.1.2.2.2 嵌合基因产生机制的探讨
• 2.1.2.2.3 鲫鱼IgM基因的序列分析
• 2.1.2.2.4 鲫鱼免疫球蛋白基因序列的比较分析
• 2.1.3 鲫鱼免疫球蛋白基因的进化分析
• 2.1.3.1 实验方法
• 2.1.3.2 实验结果
• 2.1.3.2.1 IgZ的多序列比对与进化分析
• 2.1.3.2.2 IgM的多序列比对和进化分析
• 2.1.3.2.3 硬骨鱼类免疫球蛋白的进化分析
• 2.1.4 本章小节与讨论
• 2.2 鲫鱼免疫球蛋白的免疫应答规律及其在淋巴细胞表面的标记
• 2.2.1 组织分布研究
• 2.2.1.1 实验材料与方法
• 2.2.1.1.1 实验材料和试剂
• 2.2.1.1.2 组织模板制备
• 2.2.1.1.3 RT-PCR分析
• 2.2.1.1.4 Real-Time PCR分析
• 2.2.1.2 实验结果
• 2.2.1.2.1 RT-PCR分析结果
• 2.2.1.2.2 Real-Time PCR分析结果
• 2.2.2 免疫应答分析
• 2.2.2.1 实验材料与方法
• 2.2.2.1.1 实验材料与试剂
• 2.2.2.1.2 IgM、IgMZ1和IgZ1在原核系统中的表达
• 2.2.2.1.3 多抗的制备与效价测定
• 2.2.2.1.4 鲫鱼Ig在不同刺激条件下的免疫应答
• 2.2.2.2 实验结果
• 2.2.2.2.1 IgM、IgMZ1和IgZ1在原核系统中的表达
• 2.2.2.2.2 多抗效价的测定
• 2.2.2.2.3 不同诱导条件下的抗体应答
• 2.2.3 鲫鱼免疫球蛋白在B细胞上的定位分析
• 2.2.3.1 实验材料与方法
• 2.2.3.1.1 实验材料与试剂
• 2.2.3.1.2 鼠抗IgZ多抗的制备
• 2.2.3.1.3 间接免疫荧光双染分析
• 2.2.3.1.4 细胞表面膜型Ig的免疫应答
• 2.2.3.1.5 鲫鱼淋巴细胞的分离
• 2.2.3.1.6 流式细胞仪分析
• 2.2.3.1.7 膜表面不同Ig在淋巴细胞吞噬过程中的作用
• 2.2.3.2 实验结果
• +、IgZ⁺和IgM⁺/IgZ⁺）的鉴定'>2.2.3.2.1 不同标记淋巴细胞（IgM⁺、IgZ⁺和IgM⁺/IgZ⁺）的鉴定
• 2.2.3.2.2 B细胞表面Ig在抗原刺激下的分布变化
• 2.2.3.2.3 膜表面不同Ig与淋巴细胞的吞噬作用
• 2.2.4 本章小结与讨论
• 2.2.4.1 IgZ主要存在于粘膜免疫系统中
• 2.2.4.2 淋巴细胞表面的膜型Ig分子
• 2.2.4.3 IgZ与免疫球蛋白基因的进化
• 参考文献
• 作者简历
• 博士期间的研究成果