Notch信号通路与鼻咽癌化疗耐药相关性及其机制研究

论文摘要

研究背景：化疗一直是肿瘤治疗的主要手段,然而由于肿瘤细胞耐药的产生,化疗药物并不能杀灭所有肿瘤细胞,这也是导致肿瘤复发的主要原因之一。肿瘤耐药可分为固有性耐药和获得性耐药。固有性耐药主要是指肿瘤细胞对化疗药物存在先天性抵抗、化疗敏感性差,是在化疗药物应用之前肿瘤细胞就具有的特征。尽管在化疗初始阶段,多数肿瘤细胞对化疗药物反应敏感,但是在化疗药物作用过程中逐渐产生的药物抵抗特性,称为肿瘤获得性耐药。肿瘤耐药涉及复杂的分子生化机制,迄今仍没有明确的研究结果。目前唯一明确的是具有耐药表型的肿瘤细胞包膜高表达能量依赖转运蛋白,此类蛋白可以识别并将化疗药物排除肿瘤细胞,降低化疗药物产生的细胞毒性作用,此外耐药肿瘤细胞还具有很强的DNA损伤修复能力,对抗顺铂等靶向肿瘤细胞DNA药物产生的毒性作用。Notch信号通路是由一组进化保守的细胞膜配体、受体和下游分子构成的细胞信号通路。受、配体间相互作用可激活细胞间Notch信号转导过程,启动细胞内基因转录和表达的调控。Notch信号通路的异常调控与肿瘤发生密切相关,在乳腺癌、肺癌、结肠癌、淋巴瘤及胰腺癌等人类常见肿瘤组织中都能检测到Notch受体及配体的高表达情况,异常激活的Notch信号在调控肿瘤细胞增殖、代谢和分化等过程中发挥重要作用。随着对Notch信号通路的深入研究,发现其在肿瘤化疗药物耐药过程中也发挥重要作用,Notch信号通路可能通过调控肿瘤干细胞的形成,促进肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT）过程,从而使肿瘤细胞产生耐药表型,这提示靶向Notch信号通路,有希望克服化疗过程中肿瘤细胞耐药的产生,从而减少化疗后肿瘤复发问题。γ分泌酶是Notch信号通路激活过程中的关键酶,在Notch通路激活的级联反应中起关键作用,而γ分泌酶抑制剂（GSI）可以阻断Notch受体胞内域的剪切,减少NICD释放和入核,抑伟（?） Notch信号通路激活所产生的基因转录调控作用。国内外陆续有研究显示,应用γ分泌酶抑制剂可以增加某些肿瘤细胞对化疗药物敏感性,但大部分研究缺少对Notch信号通路调控肿瘤细胞耐药机制的系统探讨。目前在鼻咽癌组织细胞中尚未见到此类研究。鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一,由于病变部位隐蔽,早期病变不易被发现,因此鼻咽癌首诊患者有60%以上已发展到中、晚期病变,并伴有不同程度的淋巴结转移。鼻咽癌病理学分型大多为非角化鳞状细胞癌（即传统病理分型中的低分化鳞癌）,对于伴有淋巴结转移的鼻咽癌患者,NCCN指南中建议先期采用顺铂化疗加同步放疗、后期补充化疗的标准治疗方案。尽管同步放化疗、辅助放化疗技术的应用和发展使鼻咽癌5年生存率提高到50%-60%,但仍有不少患者会出现局部复发或转移,这一部分患者往往对再次放化疗不敏感,预后很差。因此,本研究中我们探讨Notch信号通路与鼻咽癌顺铂耐药相关性,并对其可能机制进行深入研究,期望能够寻找一种新型特异性的分子靶向药物,为中晚期鼻咽癌患者,尤其是复发鼻咽癌患者的治疗提供新的药物选择,具有良好的应用前景。目的：通过检测鼻咽癌组织中Notch受体表达及抑制（?） Notch信号通路后鼻咽癌细胞对顺铂化疗敏感性变化,探讨Notch信号通路在调控鼻咽癌细胞耐药中的作用,并对其可能机制进行深入研究,为中晚期鼻咽癌患者,尤其是复发鼻咽癌患者的治疗提供辅助化疗药物。方法：1.量子点免疫荧光分别检测炎性鼻咽粘膜上皮、原发鼻咽癌组织、放化疗后复发鼻咽癌组织中Notch受体表达,蛋白免疫印迹检测不同分化程度鼻咽癌细胞（CNE-1、CNE-2） Notch受体表达；2.不同浓度顺铂处理分化程度不同的鼻咽癌细胞（CNE-1、CNE-2）,同时应用不同浓度Notch信号通路抑制剂DAPT和10μM顺铂联合处理CNE-2细胞,流式细胞术检测细胞凋亡水平；建立顺铂耐药低分化鼻咽癌细胞株（CNE-2/CDDP）,应用不同浓度DAPT联合1OμM顺铂共同作用耐药鼻咽癌细胞,流式细胞术检测CNE-2/CDDP细胞顺铂凋亡敏感性变化；3.不同浓度DAPT单独处理CNE-2细胞,CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测CNE-2细胞周期变化,蛋白免疫印迹检测细胞周期蛋白及细胞分化相关蛋白变化；不同浓度DAPT单独处理耐药CNE-2/CDDP细胞,蛋白免疫印迹检测EMT调控相关蛋白及顺铂耐药相关蛋白表达变化；结果：1.炎性鼻咽粘膜上皮组织中Notch受体大多呈微弱表达或不表达状态,原发鼻咽癌组织中Notch-1、Notch-4受体呈阳性表达,Notch-2、Notch-3受体表达弱阳性,复发鼻咽癌组织中Notch-1和Notch-4受体表达呈强阳性,Notch-2、Notch-3受体表达与原发鼻咽癌相比未见明显增强；高分化CNE-1细胞中Notch-1、Notch-4受体蛋白表达明显低于低分化CNE-2细胞,CNE-1和CNE-2细胞中Notch-2、 Notch-3受体表达无明显差别,但明显低于Notch-1和Notch-4低分化鼻咽癌CNE-2细胞与鼻咽癌组织中Notch受体表达呈一致性结果；2.研究中发现,高分化与低分化鼻咽癌细胞对顺铂化疗敏感性不同,经同样浓度顺铂处理,48h后高分化鼻咽癌CNE-1细胞凋亡率明显高于低分化CNE-2细胞；Notch信号通路抑制剂DAPT联合10μM顺铂处理CNE-2细胞,随着DAPT浓度增加,CNE-2细胞凋亡比率明显增加；DAPT单独作用CNE-2细胞,48h后细胞无明显凋亡出现,但细胞增殖速率受抑制,CNE-2细胞周期G1/S比例明显升高,且与DAPT浓度有剂量效应关系,接近未经处理CNE-1细胞G1/S比例,同时伴随有细胞周期调控蛋白CyclinE、CDK-2下降,与细胞分化调控相关的c-myc及p-ERK1/2蛋白表达亦有明显下降；Notch信号通路抑制剂DAPT联合10μM顺铂处理耐药鼻咽癌细胞CNE-2/CDDP,结果显示随着DAPT浓度提高,CNE-2/CDDP细胞凋亡明显上升；不同浓度DAPT单独处理耐药CNE-2/CDDP细胞,48h内细胞无明显凋亡,但细胞内Notch-1、Notch-4受体表达显著下降,与顺铂耐药相关的药物转运蛋白P-gp和DNA损伤修复蛋白ERCC1表达下调,同时与EMT调控相关的Slug蛋白表达显著下降,EMT标志分子E-cadherin表达明显上升,上述差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：研究结果显示Notch信号通路与鼻咽癌顺铂耐药关系密切, Notch-1和Notch-4受体可能参与鼻咽癌固有性耐药和获得性耐药的调控过程。在调控获得性耐药方面,抑制Notch信号通路可以提高获得性耐药鼻咽癌细胞顺铂化疗敏感性,促进CNE-2/CDDP细胞凋亡,其机制可能是通过抑制耐药鼻咽癌细胞上皮-间质转化过程,降低药物转运蛋白P-gp及DNA修复蛋白ERCC1表达,从而实现逆转细胞耐药表型过程；在固有性耐药方面发现,高分化CNE-1细胞内Notch-1、Notch-4受体显著低于低分化CNE-2细胞,但G1期细胞比例高于CNE-2细胞,而且在同样浓度顺铂作用下,高分化鼻咽癌CNE-1细胞凋亡程度明显高于低分化CNE-2细胞,进一步证明Notch-1、Notch-4受体与顺铂化疗敏感性之间的密切关系。Notch信号通路抑制剂DAPT可以提高低分化鼻咽癌CNE-2细胞顺铂化疗敏感性,这可能与Notch信号通路抑制剂可以阻滞细胞周期G1/S进展,调控分化相关蛋白,促进细胞分化有关。

论文目录

• 论文创新点
• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 中英文縮略词表
• 引言
• 第一部分 Notch受体在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞中的表达
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Notch信号对鼻咽癌细胞顺铂化疗敏感性影响
• 前言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Notch信号通路调控鼻咽癌顺铂耐药机制研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢