高灵敏度荧光免疫分析方法研究

论文摘要

发展高灵敏度的免疫分析技术一直以来是免疫分析领域研究的一个重要方面,它对于实现一些重要疾病标志物的检测有着至关重要的意义。荧光仪具有简便、灵敏、重现性好等优点。因此,开发新的荧光信号增强免疫分析技术无疑可以推动免疫分析的发展。为此,本文主要在高灵敏度的荧光免疫分析方法方面做了一些工作:1)提出了一种新的基于磁性纳米颗粒的荧光免疫检测方法。利用磁性纳米颗粒上的氨基固定C3抗原。研制了一种基于磁纳米颗粒作为生物载体,用于C3检测荧光免疫分析方法,将辣根过氧化物酶标记抗体（HRP-Ab）和磁性纳米颗粒上固定的C3（ MNPs–C3）与待测C3发生竞争性免疫反应,HRP-Ab可以催化荧光底物3 ,3′,5 ,5′-四甲基联苯胺（TMB）发生淬灭,所以待测C3浓度可由底物溶液荧光猝灭的大小来判断。C3的检测范围为1 - 40 ng/mL,检测下限达到0.8 ng/mL,该方法满足血清样品中C3检测的要求。2)提出了一种基于磁性纳米颗粒的人胸苷激酶1（hTK1）荧光免疫分析方法。hTK1通过共价吸附到核壳结构的磁性颗粒表面,与样品中的hTK1共同竞争辣根过氧化物酶标记的抗体（HRP-Ab）然后以对羟基苯丙酸（HPPA）为底物,通过测定酶催化下荧光强度的增加来间接测定样品中抗原的浓度。应用于人血清中hTK的测定,在0.01 -1 ng/mL之间呈线性关系,检测限为0.008 ng/mL。3)提出了一种基于循环富集辣根过氧化物酶的用于检测人IgG的新型荧光酶免疫分析方法。脱硫生物素与亲合素的结合常数比较小,当其与亲合素结合后,在生理条件下即可被生物素取代,利用此取代反应可对辣根过氧化物酶进行循环富集。当用缓冲液代替抗原进行实验时,发现即使循环富集步骤达到七次其产生的背景信号也相当低,这种特性使得本方法能够检测到0.05 ng/mL人IgG。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 免疫分析方法
• 1.2 免疫分析的分类
• 1.2.1 放射免疫分析（RIA）
• 1.2.2 酶免疫分析法
• 1.2.3 电化学免疫分析
• 1.2.4 荧光免疫分析（FIA）
• 1.2.5 时间分辨荧光免疫分析
• 1.2.6 化学发光免疫分析（CLIA）
• 1.3 免疫分析定量方法
• 1.3.1 夹心型免疫分析法
• 1.3.2 竞争型免疫分析法
• 1.3.3 无分离竞争抑制法
• 1.4 免疫固定方法
• 1.4.1 吸附法
• 1.4.2 交联法
• 1.4.3 物理包埋法
• 1.4.4 共价键合法
• 1.5 免疫分析的应用及发展前景
• 1.6 本论文的工作构思
• 第2章 基于磁性颗粒的人血清补体C3 荧光免疫分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂和仪器
• 2.2.2 磁性纳米颗粒的制备
• 2.2.3 核壳型磁性颗粒制备
• 2.2.4 C3 固定在核壳型磁性颗粒上
• 2.2.5 检测过程
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验机理
• 2.3.2 C3-MNPs 用量的影响
• 2.3.3 缓冲溶液和pH 的选择
• 2.3.4 温育时间的影响
• 2.3.5 酶催化时间的影响
• 2.3.6 抗原检测
• 2.4 结论
• 第3章 人胸苷激酶荧光免疫分析研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 磁性纳米颗粒的制备
• 3.2.3 磁性纳米颗粒的氨基硅烷化
• 3.2.4 磁性纳米颗粒标记hTK 和醋酸纤维素膜表面固定抗原
• 3.2.5 检测过程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 反应机理
• 3.3.2 磁性纳米颗粒的量的影响
• 3.3.3 缓冲溶液及其pH 的影响
• 3.3.4 温育时间的影响
• 3.3.5 酶催化时间的影响
• 3.3.6 免疫传感器检测hTK
• 3.4 应用
• 3.5 小结
• 第4章 基于循环富集辣根过氧化物酶的新型荧光免疫分析方法
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 脱硫生物素标记的羊抗人IgG 的制备与纯化
• 4.2.3 免疫分析流程
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 HPPA 催化产物的荧光测定
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A 攻读学位期间主要学术成果
• 致谢