抗猪瘟重组活载体疫苗及DNA疫苗的构建及其生物学特性分析

论文摘要

猪瘟（CSF）是危害我国养猪业最严重的传染病之一。尽管猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）及综合防制措施的广泛应用,已控制了猪瘟的大规模流行,但该病仍在我国广大养猪地区呈非典型性和地方性流行。伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征也是两种严重危害养猪业的传染病。以上三种传染病是目前导致母猪繁殖障碍的主要病因,而且在临床上此三种病原混合感染的情况比较普遍。因此,开发有效的联合疫苗,制定合理的免疫程序,综合防制这些传染病对养猪业的健康发展具有重要意义。 1、抗猪瘟DNA疫苗的构建及免疫效力研究据报道,牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）的VP22蛋白具有促进细胞转导作用。本试验首先应用PCR扩增了CSF病毒（CSFV）E2基因和BHV-1 VP22基因。将E2基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,获得重组质粒pcDE2,再将VP22基因连接到E2基因的下游,获得重组质粒pcDEV。将这些重组质粒转染293-T细胞,通过Western Blot分析证明E2基因获得表达;间接免疫荧光检测发现含VP22基因的重组质粒表达的E2蛋白在细胞内呈弥漫性分布,表明VP22具有胞内蛋白转导作用。进一步以鼠及兔为动物模型评价以上两种重组质粒的免疫效力。首先将21只BALB/c小鼠分三组（每组7只）,分别肌肉注射pcDNA3.1+、pcDE2、pcDEV,共免疫3次,每次间隔2周（每次每只鼠注射100ggDNA）。分别于首免后2周、4周、6周采血,用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测抗体。结果显示,通过3次免疫后,pcDE2和pcDEV免疫组均产生了针对E2蛋白的抗体,pcDEV产生的抗体滴度最高,表明VP22促进了E2蛋白的表达或提呈。将9只白兔随机分成3组（每组3只）,分别注射pcDNA3.1+、pcDE2、pcDEV,免疫三次,每次间隔两周,两后腿胫前肌肌肉注射,每只每次500μg。分别于首免后2周、4周、6周耳静脉采血,分离血清,监测抗体变化,结果显示二免后,两个重组质粒免疫组即发生了血清抗体阳转,其中pcDEV免疫组阳转率和抗体水平均高于pcDE2组。首免后7周,对所有家兔静脉注射1:40的484代猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒）（1mL/只）,攻毒之前三天每隔12h测温一次,攻毒24h后,每隔6h测体温一次,连续测96h。结果显示空质粒pcDNA3.1+免疫组3只兔在攻毒后24-48h左右开始发热,持续约36h,并呈定型热反应:pcDEV免疫组3只兔在攻毒后体温、食欲、精神状态均正常;pcDE2免疫组1只兔各项指标均正常,另外2只于48h有过性发热反应,持续约12h,体温高出正常0.5℃。本试验结果表明BHV-1的VP22基因与CSFV的E2基因融合表达可促进E2蛋白的转导及免疫效果。 2、表达多个外源基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性分析表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5蛋白的重组伪狂犬病毒（PRV）已在本实验室构建成功,动物试验证明此重组病毒疫苗免疫猪可有效抵抗PRRSV和PRV的攻击。本试验在此成功的基础上进一步将CSFV的E2基因插入到重组PRV中,期望获得可以表达PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组PRV。首先构建了含PRV TK基因片段的重组质粒,再将SV40启动子控制下的LacZ基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有CSFV E2基因表达盒和PRRSV GP5基因表达盒插入到TK基因中形成转移载体,通过同源重组将转移载体中的目的基因插入到PRV Bartha-K61株TK基因中,

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 基础-加强免疫概述
• 1.2 猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪伪狂犬病研究进展
• 1.2.1 猪伪狂犬病研究进展及猪伪狂犬病毒载体研究概况
• 1.2.2 猪瘟的研究进展
• 1.2.3 猪繁殖与呼吸综合症的研究进展
• 1.3 核酸疫苗的研究概况及VP22同源体研究进展
• 1.3.1 核酸疫苗的研究概况
• 1.3.2 BHV-1和HSV-1的VP22同源体研究进展
• 第二章 牛疱疹病毒I型VP22增强表达猪瘟E2 DNA疫苗的免疫效应研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、细胞株与宿主菌
• 2.1.2 工具酶、相关试剂及仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 连接与转化
• 2.2.3 质粒DNA的制备
• 2.2.4 E2基因及VP22基因的扩增
• 2.2.5 核酸疫苗载体的构建
• 2.2.6 质粒的提取与纯化
• 2.2.7 脂质体转染
• 2.2.8 间接免疫荧光
• 2.2.9 Western blot
• 2.2.10 真核表达质粒的动物免疫原性试验
• 2.2.11 血清抗体的阻断ELISA试验
• 2.3 结果
• 2.3.1 BHV-1 VP22基因与CSFV E2基因的PCR扩增结果
• 2.3.2 核酸疫苗载体质粒的酶切
• 2.3.3 测序结果
• 2.3.4 核酸疫苗的体外表达
• 2.3.5 动物试验结果
• 2.4 讨论
• 第三章 表达多个外源基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞、病毒及血清
• 3.1.2 质粒、PCR引物
• 3.1.3 酶和试剂
• 3.1.4 带表达盒E2基因PCR扩增
• 3.1.5 表达载体的构建
• 3.1.6 转染、重组病毒的筛选和纯化
• 3.1.7 重组病毒的鉴定及表达蛋白的检测
• 3.1.8 重组伪狂犬病毒毒力性状的变化
• 3.2 结果
• 3.2.1 GP5与E2基因的序列分析
• 3.2.2 转移载体的构建和鉴定
• 3.2.3 重组病毒的筛选
• 3.2.4 重组病毒的PCR鉴定
• 3.2.5 重组病毒表达E2和GP5的检测
• 3.2.6 rPRV-E2-GP5与Bartha-K61株在不同细胞增殖及TCID50的比较
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历