ILK在人脐带间充质干细胞向神经细胞分化中的表达变化及意义

论文摘要

目的:人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUCMSC）是从脐带组织中分离的干细胞,取材简单易获取,具有向神经细胞分化的能力,为神经系统退行性病变和损伤的细胞移植治疗提供一个新的细胞来源。但其分化机制尚不完全清楚。近年来,间充质干细胞向神经细胞诱导分化的研究有两个趋势:由间充质干细胞向专一神经细胞定向的诱导分化,如多巴胺能神经元;由间充质干细胞向神经干细胞样细胞诱导分化。有报道骨髓间充质干细胞体外特定条件下能转化为未分化的神经干细胞样细胞,未分化的神经干细胞和已分化的神经细胞相比更适合细胞移植,因为已分化的神经细胞有贴壁依赖,悬浮后及移植后存活率很低等问题。间充质干细胞来源的神经干细胞样细胞的提出,为细胞移植治疗神经系统退行性病变和损伤提供了一个新的思路,也为分化机制的研究提供了新的工具。神经干细胞样细胞是形态上类似神经干细胞呈悬浮生长的细胞球,且表达神经干细胞的标志物CD133、nestin等。因此,由间充质干细胞到神经细胞经历两个阶段,第一阶段:由间充质干细胞到神经干细胞样细胞,第二阶段:神经干细胞样细胞到神经细胞,这是一个复杂的过程,可以简化为细胞经历了贴壁到悬浮到再贴壁的一个变化过程,这一动态过程表明细胞与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的相互作用在干细胞的分化中可能有重要作用。而已知整合素连接激酶（Integrin-Linked Kinase, ILK）是一种新的细胞类型依赖的联结蛋白,能被细胞与ECM的相互作用快速激活,它通过与整合素β亚单位的结合与整合素共同介导细胞与细胞外基质的连接,影响细胞外信号向下游的传递,对细胞的生长、分化、铺展、迁移及细胞凋亡、细胞周期、细胞粘附、增殖等进行调控。所以,我们推测ILK可能在MSCs向神经细胞分化中有重要作用。目前,对UCMSC向多巴胺能神经元诱导分化的研究较少,尚无UCMSC向神经干细胞样细胞分化的报道,尚无ILK在UCMSC向神经细胞分化中的作用的研究报道。本试验首先体外诱导人脐带间充质干细胞分化为脐带源神经干细胞样细胞（neural stem cell-like cell derived from human umbilical cord, hucNSC）,并进一步向神经细胞及多巴胺能神经元诱导分化,然后研究ILK在UCMSC向神经干细胞样细胞、神经细胞诱导分化中的表达变化,siRNA-ILK抑制ILK在神经干细胞样细胞中的表达,检测抑制ILK能否抑制UCMSC向神经细胞的分化,进一步验证ILK在UCMSC向神经细胞的分化中的作用,对UCMSC向神经细胞分化的机制进行初步探讨。方法:1 UCMSC的培养和鉴定取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带,D-Hank’s液充分洗涤,将脐带剪碎至0.5cm3大小组织块,加入0.1%胶原酶II中,37℃、CO2培养箱内消化18h,将细胞接种于含20%FBS培养基中。取第3代脐带MSCs,用0.25%胰蛋白酶消化,制成浓度为3.0×106/mL的单细胞悬液。分别加入抗人的CD44-PE、CD29-APC、CD105-FITC单抗各5μL,流式细胞仪检测细胞表面分子标志。2体外预诱导UCMSCs向神经干细胞样细胞分化取第3,4代生长状态良好的UCMSCs,按1×105/mL接种于24孔板中培养和预诱导。预诱导分为三组:1、bFGF+EGF+B27;2、bFGF+EGF;3、bFGF+EGF+B27+1%FBS。药物剂量浓度为: bFGF20ng/ml, EGF20ng/ml, B27为2%。在hucNSC形成后继续培养2周后用流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD44、CD29、CD105。免疫组织化学检查分别检测nestin、CD133、NSE、GFAP、TH表达变化。3 hucNSC向神经细胞及多巴胺能神经元的诱导将hucNSC细胞球接种于预先放置有多聚赖氨酸包被的消毒盖玻片的24孔板中进行诱导分化。按在DMEM/F12培养液中加用诱导剂的不同分四组进行诱导: 1组10 % FBS ; 2组ATRA ; 3组GDNF+IL-1β; 4组ATRA+GDNF+IL-1β,药物剂量浓度为: GDNF10ng/ml,IL-1β10ng/ml,ATRA1.0μmol/l。诱导后观察记录细胞形态变化,免疫细胞化学鉴定检测NSE、GFAP和TH。RT-PCR检测诱导后细胞NSE、GFAP和TH基因表达结果。4分化过程中细胞骨架的变化准备hUCMSC、hucNSC和NC的一组细胞爬片后,0.1%TritonX-100通透5min,加AF488室温孵育20min,免疫荧光显微镜下观察并照相记录。5 ILK在分化过程中的表达变化免疫细胞化学检测ILK在hUCMSC、hucNSC和NC的表达,RT-PCR定性分析,实时荧光定量PCR分析ILK基因表达变化。6转染siRNA干扰hucNSC中ILK的表达根据ILK的NDA序列,由上海吉玛公司合成siRNA,4组序列供选择,将hucNSC细胞球培养约2周后,0.01%胰酶消化加机械吹打为单细胞悬液,按照HiPerFector说明书,转染hucNSC,提取总RNA,反转录后,实时荧光定量PCR,选出敲减ILK效果最好的siRNA序列。7转染siRNA干扰ILK后hucNSC的增殖、凋亡和分化MTT法检测转染siRNA干扰ILK后hucNSC的增殖;按凋亡试剂盒处理转染siRNA干扰ILK后的hucNSC,流式细胞仪检测细胞凋亡;用同一诱导方案（在DMEM/F12培养液中加用诱导剂ATRA、GDNF、IL-1β）诱导转染siRNA-ILK和未转染组,免疫组化检测诱导后细胞表达NSE、GFAP和TH标志物的比例。结果:1 UCMSC的培养和鉴定在原代培养2天后,可观察到大量成纤维细胞样贴壁细胞生长。在2周时,细胞达到80%～90%汇合程度;经消化后按1: 2～1: 3的比例传代的细胞。于接种后数小时内可见其迅速贴壁,约5天后,细胞完全汇合在低倍镜下呈排列紧密的漩涡样结构。培养10代余后的细胞的形态未见明显变化,增殖趋势也相对稳定。流式细胞检测证实这些细胞表达MSCs标志物CD29、CD44和CD105。2 hUCMSCs形成神经干细胞样细胞hUCMSCs在加入预诱导液（含bFGF、EGF、B27）后24h内,细胞聚集成丛、成堆,由细长梭形变为胞体为圆形或短梭形,细胞团可由数个至数百个不等细胞胞体聚集,周围伸出不规则短突起,72h内,胞体逐渐融合镜下分不清单个细胞界限,突起逐渐缩短直至形成悬浮生长的细胞球。含血清或不加B27的培养基无细胞球形成。流式细胞学检测表明, hucNSC失去原hUCMSC的细胞表型,CD29、CD44、CD105主要表面标志表达阴性。细胞聚集时nestin即表达阳性,形成的悬浮细胞球nestin、CD133呈强表达,而不表达GFAP、NSE、TH等。3 hucNSC向神经细胞及多巴胺能神经元的诱导在hucNSC培养2周后加入含10%FBS培养基后,细胞球逐渐分解,放射状伸出细胞,细胞形态不似原UCMSC,也无神经细胞的典型形态,少数细胞有较长的突起。加入含有IL-1β、GDNF、RA、的培养液,2～3 d后可见细胞呈长梭形,有的伸出很长的突起,细胞立体感强,胞核清晰,有活力,聚集的细胞逐渐分散生长,10～17d后则许多细胞体积逐渐缩小,逐渐变成小的卵圆形或圆形,不带突起或向两极伸出突起,也有的细胞呈短梭形带有长长的突起或小圆胞体带有多突起,胞体折光性强,有的胞体不规则但突起较多,细胞突起可见连接成网。免疫细胞化学分析结果:加入10%FBS仅出现少量的GFAP分化细胞,加入含有IL-1β、GDNF、RA组GFAP为21.1±3.5%,NSE为57.4±4.3%,TH为9.2%±3.1%,明显高于单独应用RA或IL-1β、GDNF各组,p<0.01。RT-PCR分析进一步在mRNA水平上证实了诱导的细胞神经标志物表达GFAP、NSE、TH。4 hUCMSCs向神经干细胞样细胞、神经细胞分化过程中细胞骨架的变化hUCMSCs细胞内F-acting呈纵向丝状规律排列,hucNSC细胞聚集成球,细胞骨架回缩,呈巢状,无伸展形态,诱导后的神经细胞胞体F-acting呈网状,细胞有极性形成,呈轴状,相邻细胞细胞骨架可连接成网。5 ILK在hUCMSCs向神经干细胞样细胞、神经细胞分化过程中表达变化（1）免疫细胞化学检测未见hUCMSC中有ILK的表达, hucNSC呈悬浮状态细胞中表达ILK,免疫荧光双标显示同时表达nestin或CD133;在诱导后神经细胞中,ILK继续呈强表达,（2）RT-PCR和Real Time PCR检测结果:ILK在hUCMSC中微量表达,在转化为hucNSC后ILK表达明显上调,进一步诱导的神经细胞中ILK表达仍维持较高水平;Real Time PCR定量分析显示ILK在hucNSC中的表达水平是hUCMSC表达水平的12倍,ILK在诱导后神经细胞中的表达水平高于hUCMSC8.6倍,hUCMSC与诱导后的hucNSC、神经细胞ILK表达均有显著差异（卡方检验,p<0.05）。6转染siRNA干扰ILK及转染后hucNSC的增殖、凋亡和分化最佳siRNA序列,正义链:5’-GAAUCUCAACCGUAUUCCATT-3’,反义链:5’-UGGAAUACG GU UGAGAUUCTG-3’,敲减率在75%以上。转染ILK-siRNA的细胞增殖活性明显降低,72h抑止率为64.5±0.5%。转染了ILK siRNA的细胞有11.2 %的细胞在早期凋亡阶段, 9.1 %的细胞在晚期凋亡阶段或死亡。抑止hucNSC的ILK表达后,继续向神经细胞诱导分化,结果GFAP为11.6±1.5%,NSE为16.3±2.1%,TH为1.5%±0.3%,在同一诱导条件下,和对照组相比各种神经细胞的分化比例均明显降低（p<0.05）。结论:从人脐带中可用胶原酶消化法培养得到间充质干细胞,细胞形态如成纤维样细胞,可传代、冻存和复苏,高水平表达CD29、CD44、CD105细胞表面标志。脐带间充质干细胞在EGF、bFGF、B27的无血清培养基预诱导作用下,可转变为悬浮生长的细胞球,表达nestin和CD133,能增殖和传代,在撤去EGF、bFGF、B27加入含血清培养基下,仅能分化为少量表达GFAP的细胞,尚不能分化神经细胞的各型细胞,在神经细胞诱导剂作用下可向神经细胞诱导分化。我们称这类细胞为脐带源神经干细胞样细胞。在ATRA、IL-1β和GDNF作用下可向神经细胞分化并可获得约10%的多巴胺能神经元。在人脐带间充质干细胞向神经干细胞样细胞、神经细胞诱导分化中,细胞骨架重新排列,ILK表达上调表明人脐带间充质干细胞向神经干细胞样细胞、神经细胞诱导分化及细胞形态重塑中ILK可能发挥重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 ILK在人脐带间充质干细胞向神经细胞分化中的表达变化及意义
• 引言
• 第一部分 人脐带间充质干细胞的培养和鉴定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 人脐带间充质干细胞向神经干细胞样细胞、神经细胞的诱导和分化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 ILK 在人脐带间充质干细胞向神经细胞分化中的表达变化及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述一 整合素连接激酶的研究进展
• 综述二 RNA 干扰技术的研究进展
• 致谢
• 个人简历