斑马鱼两个基因在黑尾近红鲌胚胎发育中的整体原位杂交研究

论文摘要

本研究利用人工催产,干法受精,胚胎固定等方法对黑尾近红鲌的胚胎发育进行了初步观察。同时利用模式生物斑马鱼的nanos探针和eomes探针对黑尾近红鲌的不同发育时期的胚胎进行整体原位杂交,来研究这两个基因在黑尾近红鲌胚胎发育中的表达。结果如下:1.黑尾近红鲌胚胎发育从受精到出膜在24℃左右时需要将近50h左右,经历卵裂期、囊胚期、原肠期、器官发育和完善期,然后孵化。出膜后的胚胎整体透明,除眼点位置外没有任何色素。2.nanos作为生殖细胞的标记基因在黑尾近红鲌原始生殖细胞(primordial germcell,简称PGC)中表达,其RNA的表达最早在受精后4h左右,囊胚中期在动物极分散表达,而后逐渐集中,并在发育过程中逐步迁移到生殖嵴。其表达在黑尾近红鲌胚胎发育的卵裂期和在斑马鱼同期胚胎中的表达不同,但在中后期胚胎中的表达与斑马鱼中的表达相同,呈现出其特定表达模式。3.eomes是神经系统的标记基因,在端脑表达。eomes RNA在黑尾近红鲌中的表达最早从7h左右开始并在以后的发育中逐渐增强,7h之后逐渐向两侧迁移并呈对称状。在黑尾近红鲌的胚胎发育卵裂期没有观察到和在斑马鱼中相同的表达情况,在中后期的表达模式与在斑马鱼中相同。用整体原位杂交的方法研究不同生物之间的基因表达模式有两个关键,一是基因之间序列的相似性,二是基因的表达情况,即表达量和表达位置。当基因的序列相似性和表达量都比较高且在胚胎发育的表层表达时,利用整体原位杂交来研究其在另外一种生物中的表达情况是一个很好的选择。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 前言
• 第一章 文献综述及研究目的意义
• 1.1 模式生物斑马鱼生物学特点和研究现状
• 1.1.1 斑马鱼的生物学特点
• 1.1.2 斑马鱼的研究现状
• 1.2 黑尾近红鲌研究现状
• 1.2.1 黑尾近红鲌简介
• 1.2.2 黑尾近红鲌研究现状
• 1.3 nanos研究现状
• 1.4 eomes研究现状
• 1.5 原位杂交技术的发展和应用
• 1.5.1 原位杂交技术的原理
• 1.5.2 原位杂交技术的发展历史
• 1.5.3 原位杂交技术的应用
• 1.5.4 RNA原位杂交的应用
• 1.6 本研究目的和意义
• 第二章 黑尾近红鲌胚胎发育研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 试验试剂和仪器
• 2.1.3 胚胎收集
• 2.1.4 胚胎固定
• 2.1.5 胚胎脱膜
• 2.1.6 胚胎观察
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 黑尾近红鲌的胚胎发育结果
• 2.2.2 黑尾近红鲌胚胎发育讨论
• 第三部分 斑马鱼nanos和eomes克隆以及整体原位杂交
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 常用试剂配方及保存方法
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 丙酮粉的制备
• 2O的配制'>3.2.2 DEPC·H₂O的配制
• 3.2.3 斑马鱼不同组织总mRNA的抽提
• 3.2.4 cDNA的合成
• 3.2.5 基因克隆及测序鉴定
• 3.2.6 pGEM-nanos/eomes质粒的酶切线性化
• 3.2.7 地高辛标记的原位杂交探针的体外转录合成
• 3.2.8 胚胎的准备
• 3.2.9 胚胎的预杂交和杂交
• 3.2.10 杂交后漂洗
• 3.2.11 杂交信号的检测（染色）
• 3.3 试验技术路线
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 结果
• 3.4.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文