莱茵衣藻海藻糖水解酶基因treh在E.coli中表达及功能鉴定

论文摘要

海藻糖被认为是生物体抵御胁迫环境的应激代谢产物,对细胞膜、蛋白质和核酸等生物大分子有卓越的保护作用,能明显提高生物的抗逆能力。海藻糖的保护机理和生物代谢途径一直是研究的热点。我们最近首次在衣藻中检测到了海藻糖的存在。本实验从衣藻中克隆到海藻糖水解酶同源基因（trehalase gene,以下简称treh）的cDNA序列,并将该基因在大肠杆菌中诱导表达,对其重组蛋白产物的酶活鉴定证实其具有海藻糖水解酶活性。本研究的结果填补了衣藻在海藻糖研究方面的空白。本论文的主要内容及结果如下:1.提取衣藻RNA反转录成cDNA,利用PCR技术克隆得到衣藻的treh,通过限制性内切酶位点EcoRⅠ和BamHⅠ将其连接到克隆载体pUC19上,得到载体pUC-treh,测序得到treh的cDNA序列。2.生物信息学分析表明衣藻Treh与水稻、拟南芥、大豆的海藻糖水解酶具有较高的同源性。3.利用上述双酶切位点构建了大肠杆菌表达载体pET32a-treh.4.用IPTG在大肠杆菌中成功诱导表达衣藻treh,该基因的重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在。5.收集目的蛋白包涵体,经过变性和复性处理得到有功能的Treh蛋白。但样品中存在杂蛋白干扰。6.进一步利用表达载体pET32a上带有的His-tag标签对复性的目的蛋白用镍柱进行二次纯化,去除杂蛋白。再对得到的纯Treh蛋白进行透析,酶活鉴定表明其具有海藻糖水解酶活性,比活力达到80.4U/mg protein。7.实验证明咪唑会导致Treh的酶活性完全被抑制,必须通过透析去除后才能使蛋白恢复活性。而0.05mM EDTA和1mM的Mg2+对其活性无影响。综上所述,本实验成功从衣藻中克隆到预测的海藻糖水解酶基因treh,其在大肠杆菌中表达的产物被证实具有海藻糖水解酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 海藻糖的分子结构及理化性质
• 1.2 海藻糖对生物体的保护功能及其保护机理
• 1.2.1 海藻糖在活体内和离体条件下均对生物体具有保护作用
• 1.2.2 海藻糖对生物大分子的保护机理
• 1.2.2.1 “水替代”假说——Water replacement Hypothesis
• 1.2.2.2 “玻璃态”假说——Glassy State Hypothesis
• 1.2.2.3 “优先排阻”假说
• 1.3 海藻糖的其它生理功能
• 1.3.1 作为细胞结构成分
• 1.3.2 为生命活动提供能量
• 1.4 海藻糖的应用
• 1.4.1 食品工业
• 1.4.2 抗食物过敏
• 1.4.3 医药工业
• 1.4.3.1 预防亨廷顿病
• 1.4.3.2 抑制中老年人体臭
• 1.4.4 化妆品工业
• 1.4.5 分子生物学研究
• 1.4.6 植物基因工程
• 1.4.6.1 提高植物的抗逆性
• 1.4.6.2 海藻糖生产的载体
• 1.4.6.3 海藻糖合成基因作为转基因植物的筛选标记
• 1.4.6.4 海藻糖酶抑制剂作为杀虫制剂
• 1.4.7 海藻糖的其他应用
• 1.4.7.1 诱导纤维素酶的合成
• 1.4.7.2 海藻糖与镁的相互作用
• 1.5 海藻糖合成途径及其相关基因
• 1.5.1 在酵母中的代谢途径
• 1.5.2 通过海藻糖合成酶以葡萄糖为底物合成海藻糖
• 1.5.3 通过海藻糖合成酶以麦芽糖为底物合成海藻糖
• 1.5.4 通过糖基转移酶和淀粉酶合成海藻糖
• 1.5.5 通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶生成海藻糖
• 1.6 衣藻的研究进展
• 1.6.1 莱菌衣藻的生理特征
• 1.6.2 莱茵衣藻的培养
• 1.6.3 莱茵衣藻的遗传背景
• 1.6.4 作为模式物种
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、菌株与藻株
• 2.2 方法
• 2.2.1 衣藻的培养、纯化、保种及扩大培养
• 2.2.1.1 培养
• 2.2.1.2 纯化
• 2.2.1.3 保种
• 2.2.1.4 扩大培养
• 2.2.2 衣藻中treh 基因的克隆
• 2.2.2.1 衣藻总 RNA 的提取
• 2.2.2.2 衣藻总 RNA 反转录成cDNA
• 2.2.2.3 以衣藻cDNA 为模板扩增treh 基因
• 2.2.2.4 构建质粒载体的连接反应体系
• 2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2.6 大肠杆菌的转化
• 2.2.2.7 克隆载体的鉴定
• 2.2.3 质粒 DNA 提取、酶切鉴定和基因测序
• 2.2.3.1 碱裂解法少量制备质粒 DNA
• 2.2.3.2 DNA 酶解反应体系
• 2.2.3.3 DNA 酶切片段的纯化和回收
• 2.2.3.4 DNA 序列的测定
• 2.2.4 DNA 序列的生物信息学分析
• 2.2.4.1 将克隆所得的衣藻treh 基因序列在衣藻网上进行序列性质对比
• 2.2.4.2 蛋白质一级结构预测
• 2.2.4.3 蛋白质二级结构预测
• 2.2.5 目的基因在 E.coli 中的诱导表达及功能鉴定
• 2.2.5.1 IPTG 诱导目的基因的表达
• 2.2.5.2 E.coli 可溶性蛋白与不可溶蛋白的提取、分离
• 2.2.5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 胶的制备
• 2.2.5.4 包涵体的溶解
• 2.2.5.5 变性蛋白的透析
• 2.2.5.6 过镍柱浓缩纯化复性的目的蛋白
• 2.2.6 诱导表达的蛋白酶活性的测定
• 2.2.6.1 酶活的测定原理
• 2.2.6.2 葡萄糖氧化法试剂的配制
• 2.2.6.3 葡萄糖溶液标准曲线的测定
• 2.2.6.4 海藻糖水解酶反应时间与酶活的关系
• 2.2.6.5 酶活测定方法
• 2.2.6.6 酶活单位的定义
• 2.2.7 衣藻总蛋白提取和海藻糖水解酶活性的测定
• 2.2.7.1 衣藻生长曲线的测定
• 2.2.7.2 海藻糖水解酶提取缓冲液的配制
• 2.2.7.3 衣藻粗蛋白的提取
• 2.2.7.4 衣藻粗蛋白的脱盐处理
• 2.2.7.5 脱盐后的粗蛋白的酶活测定
• 2.2.7.6 可溶性蛋白的标准曲线
• 3 结果与分析
• 3.1 衣藻的同步化培养
• 3.1.1 同步化培养条件
• 3.1.2 衣藻生长曲线的测定
• 3.2 衣藻粗蛋白中的海藻糖水解酶活性
• 3.3 衣藻treh 基因的克隆
• 3.3.1 衣藻总 RNA 的提取及cDNA 的反转录
• 3.3.2 从衣藻cDNA 中克隆treh 基因
• 3.3.3 衣藻treh 基因的测序
• 3.4 生物信息学分析
• 3.4.1 衣藻treh 基因的 DNA 同源性分析
• 3.4.2 衣藻treh 翻译蛋白的性质分析
• 3.4.2.1 翻译蛋白质的一级结构预测及同源性分析
• 3.4.2.2 翻译蛋白的氨基酸含量分析
• 3.4.2.3 翻译蛋白质的二级结构预测
• 3.5 衣藻treh 在大肠杆菌中的表达纯化与酶活分析
• 3.5.1 大肠杆菌中表达载体的构建
• 3.5.2 大肠杆菌中目的基因的诱导表达
• 3.5.3 包涵体的变性与复性
• 3.5.4 复性蛋白的纯化
• 2+及 EDTA 对酶活的影响'>3.5.5 Mg²⁺及 EDTA 对酶活的影响
• 4 讨论与展望
• 4.1 研究莱茵衣藻中海藻糖代谢的意义
• 4.1.1 有助于了解高等植物的海藻糖代谢机理和作用
• 4.1.2 莱茵衣藻中海藻糖代谢研究的展望
• 4.2 大肠杆菌表达外源基因
• 4.2.1 大肠杆菌作为宿主的优势
• 4.2.2 大肠杆菌表达产物的活性
• 4.3 生物信息学对未知蛋白的预测
• 4.4 各种化学试剂对纯化蛋白活性测定的影响
• 5 总结
• 5.1 克隆了莱茵衣藻的海藻糖水解酶基因treh
• 5.2 大肠杆菌中诱导表达目的蛋白与蛋白功能测定
• 参考文献
• 附录
• 致谢