脊髓损伤模型大鼠的胃肠动力障碍及其电针调整作用的研究

论文摘要

目的:1研究脊髓损伤后大鼠的胃肠动力的改变,初步探讨脊髓损伤后胃肠动力障碍的可能的发病机理。2通过检测电针足三里前后胃内核素残留率、小肠推进率以及脑肠肽、脑肠肽受体、NOS等的改变,了解电针对脊髓损伤后胃肠动力障碍的调整作用,推断电针作用的可能途径和机制。方法:1脊髓损伤模型建立:用WD法建立脊髓损伤模型,采用BBB评分法,选择BBB评分0分的大鼠为造模成功。2大鼠的运动能力评定:采用改良后CBS法进行动物运动行为评分,观察指标包括开放空间运动能力、脚趾伸展、触地反射、回缩反射、翻正反射、斜板试验。并且对大鼠双后肢的运动功能观察,采用BBB评分。3分组:随机分正常对照组、模型对照组、非经非穴组、电针治疗组和莫沙比利治疗组。①正常对照组:对正常的大鼠,每日固定30 min,但不行电针刺,连续14天。②模型对照组:对脊髓损伤模型大鼠,每日固定30min,但不行电针刺,连续14天。③非经非穴组:对脊髓损伤模型大鼠,每日电针治疗（选“足三里”穴旁0.5 cm处,频率、强度同（3）组）30 min,连续14天。④电针治疗组:对脊髓损伤模型大鼠,每日电针足三里治疗30min,连续14天。（穴位选双侧足阳明胃经上的“足三里”穴）。⑤莫沙比利治疗组:对脊髓损伤模型大鼠,每日给予莫沙比利灌胃,连续14天。4取穴和针刺方法:“足三里”穴,根据中国针灸学会实验针灸研究会指定的“动物针灸穴位图谱”选取双侧足三里穴（在大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处）。大鼠清醒固定,各电针组动物均在造模成功后一周开始针刺,足三里穴直刺7mm,连接胃肠促动型医用数码电针治疗仪,参数选为:连续波,电针频率为3Hz,强度为2-3mA,针刺30min,每天1次。5胃排空和小肠推进比的检测:各组大鼠于造模后第7天和第21天时,随机抽取10只大鼠,每组灌服混有99m碍-二乙三胺五乙酸(99mTc-DTPA)0.05毫居（mCi）/10g和少量亚甲兰的营养性半固体糊标准餐20ml/kg,胃内核素残留率（%）=（胃内核素残留值/基准值）×100%,小肠推进比（%）=（幽门括约肌至色素前端的距离（cm）/幽门括约肌至回盲部的距离（cm））×100%。6脊髓组织病理观察:于造模后第1,7天,正常组和造模组随机抽取3只大鼠处死,以T12为中心取长约1.0cm脊髓,以4%多聚甲醛固定24小时后,常规石蜡包埋,连续切片,片厚5μm,备用,行HE染色,观察脊髓组织形态学变化。7胃动素、胃泌素、血管活性肠肽和生长抑素的测定:采用放射免疫分析法,血浆、血清及组织标本在测定前混匀,4℃1500转/min离心15分钟,取上清液测定胃动素、胃泌素、血管活性肠肽和生长抑素的含量。8一氧化氮合酶的检测:于造模后第3周,大鼠处死,取1cm胃窦和十二指肠组织,于4.0%多聚甲醛中固定,包埋,切片,用免疫组织化学技术检测胃肠组织iNOS蛋白的表达,采用SABC（Strept Avidin-Biotin Complex,链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶）法检测;并用RT-PCR测定胃窦和小肠组织iNOS mRNA的表达。9 MTLRmRNA和SSR mRNA表达:采用RT-PCR测定MTLR mRNA和SSRmRNA表达,用多媒体凝胶成像分析系统计算各样本PCR产物的光密度值。计算各样本MTL-R1A mRNA及SSTR2 mRNA与内参β-actin mRNA PCR产物的积分光密度比值,比值的高低反映了MTL-R1A mRNA及SSTR2 mRNA在样本中表达量的多少。结果:1脊髓损伤后不同时间各组大鼠CBS评分结果:正常组的大鼠脊髓神经的运动功能正常,模型组大鼠双后肢软瘫,肌张力低,损伤平面以下各种反射不同程度的减弱或消失,第造模后第7天和第21天,CBS评分与正常组比较有非常显著性降低,P＜0.01。2大鼠胃内残留率和小肠推进比:实验1周后,即造模后,脊髓损伤模型各组,与正常组相比胃内残留率和小肠推进比均有显著差异（P＜0.01）;经过电针治疗后,即实验3周后,模型组胃内残留率仍比正常组明显增加（P＜0.01）,而电针组明显低于模型组（P＜0.01）;3周后,小肠推进比模型组较正常组仍明显减少（P＜0.01）,而电针组明显高于模型组（P＜0.01）;电针组在电针治疗前后胃内残留率和小肠推进比有显著差异（P＜0.01）。3脊髓组织形态学变化:正常组术后24h脊髓HE染色结果正常;而模型组损伤后24h:HE染色可见损伤区及邻近区域脊髓组织丧失正常的结构,有明显的组织破坏、坏死、空泡形成。灰、白质内明显可见大量、弥散的红细胞。损伤后1周:损伤区及邻近区域脊髓丧失正常结构,灰、白质内可见到脊髓液化坏死,形成空泡,灰、白质内出血消失。同时有大量的炎性细胞及巨噬细胞浸润,排列紊乱,神经元极少见到。4胃动素、胃泌素、血管活性肠肽和生长抑素的测定结果:①脊髓损伤可使大鼠血液及组织中的MTL含量降低;电针组可使大鼠血液和胃窦组织和十二指肠组织中MTL含量明显上升,作用与西药组的作用相当。②脊髓损伤可使大鼠血液及胃窦和十二指肠组织中的GAS含量明显降低,而电针组可明显增加血液中的GAS含量,而对胃窦和十二指肠组织中的GAS含量变化作用不明显。③脊髓损伤可使大鼠血液及胃肠组织中的VIP含量升高。电针足三里能降低血液及胃窦组织中VIP含量,对十二指肠中VIP含量增高作用不明显;与莫沙比利相比较,电针足三里对胃窦组织的作用优于莫沙比利。④脊髓损伤后大鼠血液及组织中的SS含量升高。电针足三里能降低血液及胃窦和十二指肠组织中SS含量,作用相当于莫沙比利。5脊髓损伤大鼠NOS的改变和电针的调整作用:①iNOS在胃和小肠组织中的表达:在正常组中,iNOS在胃黏膜上皮细胞浆中少量表达,而在模型组和穴旁组中,iNOS在胃黏膜的表达较正常明显增加（P＜0.01）,治疗后,电针组和西药组明显减少（P＜0.01）;模型组和穴旁组与正常组比较iNOS表达明显增加（P＜0.01）,经过治疗,电针组iNOS表达有所改善,明显减少,与模型组比较有显著差异,而西药组与正常组比较未见明显差异。②胃和肠组织iNOS mRNA:胃和肠组织中,模型组iNOS mRNA的表达增加（P＜0.05）;电针组与模型组和穴旁组相比较,iNOS mRNA的表达显著减少（P＜0.01）。6脊髓损伤大鼠胃窦MTL-R1A mRNA及结肠SSTR2 mRNA表达的改变和电针的调整作用:MTL-R1A mRNA中,模型组的光密度积分比值明显降低,与正常组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）;电针组及西药组与模型组比较,平均光密度积分比值均升高,有非常显著性差异（P＜0.01）。SSTR2 mRNA中,模型组的平均光密度比值明显升高,与正常组比较,有非常显著性差异（P＜0.01）;电针组与模型组比较,比值降低,有非常显著性差异（P＜0.01）。结果表明,脊髓损伤后大鼠MTL-R1A mRNA表达下调,电针足三里上调MTL-R1A mRNA表达,作用相当于莫沙比利;脊髓损伤后大鼠SSTR2mRNA表达增加,电针足三里下调SSTR2mRNA表达,作用优于莫沙比利。结论1根据改良的WD方法建立脊髓损伤大鼠模型,模型组造模后第7、21天改良的CBS评分与正常组有明显差异,组织学观察符合临床脊髓损伤患者的病理变化,证实建立的SD大鼠脊髓损伤模型是成功的。2脊髓损伤大鼠存在胃肠动力障碍,本实验中主要表现为胃排空和小肠推进运动功能的下降,因此,脊髓损伤后胃肠的动力下降;电针足三里可以改善胃肠的排空率,促进胃肠的运动,因此,电针足三里对胃肠动力有促进的作用。3脊髓损伤大鼠存在胃肠激素的紊乱和电针的调整作用:①血浆和组织中MTL的下降可能是造成脊髓损伤后胃肠运动功能障碍的原因之一,MTL主要通过内分泌和局部神经分泌的方式影响脊髓损伤后的胃肠运动。电针足三里可以通过升高血液和组织中的MTL,促进胃肠动力。②血浆和胃肠组织中GAS的下降可能是脊髓损伤后胃肠功能障碍的发病机制之一,GAS既可以内分泌的方式,也可以局部神经分泌的方式影响脊髓损伤后胃肠动力。电针足三里可以通过升高血液中的GAS,以内分泌的方式促进脊髓损伤后胃肠动力。③血浆和组织中VIP的升高可能是引起脊髓损伤后胃肠运动功能障碍的原因之一,电针足三里对VIP的调整不仅以内分泌的形式起作用,其胃窦组织中VIP含量也下降,因而电针足三里以血液循环和胃窦组织局部分泌的方式影响脊髓损伤后的胃肠动力。④血浆和组织中SS的升高可能是脊髓损伤后胃肠功能障碍发病机制之一,电针足三里后,可能通过降低抑制性脑肠肽SS的释放,以血液循环和局部分泌的形式调整胃肠动力的紊乱。4脊髓损伤后胃肠动力障碍的发生可能与局部组织中脑肠肽受体mRNA的表达水平有关,当对胃肠平滑肌细胞有兴奋效应的脑肠肽受体的mRNA表达水平下降,或对胃肠平滑肌细胞有抑制效应的脑肠肽受体的mRNA表达水平上升时,则可能会出现胃肠动力障碍,MTL-R1A、SSTR2的基因表达异常可能参与了SCI后的胃肠动力下降的发病;电针足三里对脊髓损伤后胃肠动力障碍的影响可能通过受体的调节方式来实现,通过上调MTL-R1A、下调SSTR2的基因表达,来调节胃肠运动,达到促进胃肠动力的作用。5 NO能神经可能参与了脊髓损伤后胃肠动力障碍的发病机制,脊髓损伤后可能通过iNOS蛋白和基因水平的上调导致胃肠动力障碍;而针刺足三里治疗脊髓损伤后胃肠动力障碍的机制可能与降低NO能神经兴奋性有关,针刺足三里在胃肠动力障碍的状态下,可以下调iNOS蛋白水平和基因的表达,进而促进胃肠动力;以上可能通过调节神经递质NO的释放来实现。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分:文献研究
• 1 与脊髓损伤相关的胃肠动力障碍的现代研究进展
• 1.1 脊髓损伤后的胃肠道动力障碍的概况
• 1.2 脊髓损伤的机理
• 1.3 胃肠动力病新概念和曼谷分类
• 1.4 胃肠动力障碍的发生机制
• 1.5 脊髓损伤后为胃肠动力紊乱机制
• 1.6 脊髓损伤后消化道动力紊乱表现
• 1.7 脊髓损伤后胃肠道动力紊乱的治疗
• 2 脊髓损伤和胃肠动力障碍的针灸治疗的研究进展
• 2.1 针灸治疗脊髓损伤的研究进展
• 2.2 针灸调节胃肠动力障碍的研究
• 3 祖国医学对脊髓损伤的研究
• 3.1 脊髓损伤的中医病机
• 3.2 脊髓损伤的中医治疗
• 4 祖国医学对胃肠动力障碍的研究
• 4.1 中医对胃肠动力障碍的病因病机的研究进展
• 4.2 中医药治疗胃肠动力障碍的进展
• 5 足三里的研究进展
• 5.1 足三里的定位和层次结构
• 5.2 针刺足三里对胃肠功能的影响
• 5.3 针刺足三里穴对脑肠肽的影响
• 5.4 足三里反射途径的研究
• 第二部分:实验研究
• 实验一 脊髓损伤大鼠模型的建立及胃肠动力障碍
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验二 脊髓损伤对脑肠肽的影响和电针的调整作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 实验三 脊髓损伤大鼠NOS的改变和电针的调整作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 2mRNA表达的改变和电针的调整作用'>实验四 脊髓损伤大鼠胃窦MTL-R1AmRNA及结肠SSTR₂mRNA表达的改变和电针的调整作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第三部分:讨论
• 1 脊髓损伤大鼠模型的选择依据和评估
• 1.1 脊髓损伤大鼠模型的理论依据
• 1.2 脊髓损伤模型的评估标准
• 1.3 脊髓损伤大鼠模型的评估分析
• 2 脊髓损伤对胃肠动力的影响和电针的调整作用
• 2.1 脊髓损伤后胃肠动力障碍的理论依据
• 2.2 足三里的选择依据
• 2.3 电针频率的选择依据
• 2.4 对照组的选择依据
• 2.5 实验结果的分析
• 3 脊髓损伤对脑肠肽的影响和电针的调整作用
• 3.1 胃动素
• 3.2 胃泌素
• 3.3 血管活性肠肽
• 3.4 生长抑素
• 4 NOS在脊髓损伤后胃肠动力障碍中的改变和电针的调整作用
• 4.1 指标的选择依据
• 4.2 实验结果的分析
• 2mRNA的表达在脊髓损伤后胃肠动力障碍中的改变和电针的调整作用'>5 胃窦MTL-R1AmRNA及结肠SSTR₂mRNA的表达在脊髓损伤后胃肠动力障碍中的改变和电针的调整作用
• 5.1 指标选择的依据
• 5.2 实验结果的分析
• 第四部分:结语
• 1 本课题的结论
• 2 本课题创新之处
• 3 工作中的不足
• 4 展望
• 参考文献
• 附录:英文缩略表
• 在校期间发表论文
• 致谢