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人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究

2020-12-07阅读(862)

人胚胎干细胞体内向肌细胞分化的研究

论文摘要

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hES细胞）是能向多种细胞类型分化的全（多）能性干细胞,如何将这类细胞诱导分化成骨骼肌细胞,为治疗肌肉退行性疾病,如杜氏肌营养不良症（Duchenn’s Muscular Dystrophy,DMD）,提供足够数量的细胞来源,一直是干细胞分化研究领域的热点。本研究针对这一问题进行探讨,以人ES细胞系SHES 39作为实验材料,成功的将SHES 39细胞在体外诱导成骨骼肌细胞的前体细胞。建立合适的小鼠肌肉损伤模型后,将这些前体细胞移植入小鼠肌肉中,能进一步整合分化为骨骼肌细胞和肌肉组织干细胞——卫星细胞。实验结果如下:1.为了建立合适的肌肉损伤模型,对20 ug心肌毒素（cardiotoxin）单独处理以及处理24小时后辅以X-射线局部照射小鼠胫骨前肌这两种方案进行比较,并对18,25和50Gy的照射剂量进行比较。病理检查的结果证实:心肌毒素能在注射部位对肌肉造成严重破坏,大部分骨骼肌细胞变性坏死;辅以25Gy的X-射线局部照射能明显抑制肌细胞损伤后内源性细胞的修复增生,大大提高人源性细胞的整合率（28.65%±13.69%,P<0.01）。另外,18Gy的照射剂量也可达到相似效果,但50Gy的照射剂量效果相对较差。2.利用经典遗传学的杂交-互交方法,将8周龄的非糖尿病-严重联合免疫缺陷（NOD/scid）雄鼠（scid-/-）与mdx纯合雌鼠（mdx-/-）相杂交,再用其所生的8周龄F1代雄鼠（scid+/-/mdx-/-）和雌鼠（scid+/-/mdx+/-）互交,提取46只F2代杂合子小鼠的基因组DNA,对dystrophin以及scid基因进行PCR检测,共获得13只双基因缺陷的纯合小鼠（ scid-/-/mdx-/-）,作为研究杜氏肌营养不良症的免疫缺陷型动物模型。3.人胚胎干细胞悬浮培养,诱导分化成类胚体,在合适培养液中贴壁后继续分化生长,多次传代,直至形成类似于成纤维细胞样的骨骼肌前体细胞后,将这些前体细胞植入经心肌毒素+25Gy X-射线局部照射联合处理的NOD-SCID小鼠胫骨前肌。为了确定最佳的细胞移植时间,分别在照射后0小时、24小时、48小时三个时点进行细胞移植的实验。免疫组化结果表明:照射后24小时或48小时进行移植的外源细胞整合率相对较高,分别为24.32%和23.48%。4.心肌毒素+25Gy X-射线局部照射联合处理NOD-SCID小鼠24小时后,将hES来源的前体细胞移植到NOD-SCID小鼠的胫骨前肌中,2-16周后取材做冰冻切片,随后的免疫组化和原位杂交结果证实,约10%-20%的细胞能整合分化成骨骼肌细胞,并表达人特异性的dystrophin基因,部分细胞能分化成为卫星细胞,并表达卫星细胞的相关标志,如pax7等。将这些细胞以同样方式移植入免疫缺陷的杜氏肌营养不良症的动物模型-scid/mdx小鼠肌肉后,也能整合分化成骨骼肌细胞并表达dytrophin基因。5.在hES细胞来源的前体细胞移植后14-128天的共12只小鼠（26处移植位点）中,都有人源性的细胞整合,而未见畸胎瘤的形成。说明hES细胞有潜力成为临床治疗杜氏肌营养不良症的细胞来源。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 文献综述
  • 1 骨骼肌细胞的发生及其调控
  • 2 骨骼肌细胞的退化、病变
  • 3 骨骼肌细胞重建的细胞来源
  • 3.1 成肌细胞
  • 3.2 卫星细胞
  • 3.3 骨髓来源的干细胞
  • 3.4 其他肌源性前体细胞
  • 3.5 胚胎干细胞和原始生殖细胞
  • 4 骨骼肌细胞的重建途径
  • 5 骨骼肌细胞重建的分子机制
  • 6 骨骼肌细胞诱导分化的研究现状
  • 7 本研究的目的和意义
  • 第二章 实验部分
  • 实验一 构建细胞移植的动物模型
  • 材料和方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 实验方法
  • 2.1 小鼠肌肉损伤模型的建立
  • 2.2 DMD 免疫缺陷型小鼠模型的建立
  • 2.2.1 基因组 DNA 的提取
  • 2.2.2 PCR 反应
  • 实验结果
  • 1 小鼠肌肉损伤模型的建立
  • 2 DMD 免疫缺陷型小鼠模型的建立
  • 2.1 Dystrophin 基因鉴定
  • 2.2 Scid 基因鉴定
  • 讨论
  • 实验二 人胚胎干细胞体内向骨骼肌细胞分化的诱导
  • 材料和方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 细胞来源
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 1.3.1 细胞培养试剂
  • 1.3.2 免疫细胞化学试剂
  • 1.3.3 其他试剂
  • 1.4 主要仪器
  • 2 实验方法
  • 2.1 hES 细胞的体外扩增培养
  • 2.1.1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备
  • 2.1.2 人 ES 细胞的体外培养
  • 2.1.3 hES 细胞的初步诱导
  • 2.2 照射剂量和移植时间的分析
  • 2.3 细胞移植
  • 2.3.1 细胞移植入 NOD-SCID 小鼠
  • 2.3.2 细胞移植入scid/mdx 小鼠
  • 2.4 组织标本的搜集和分析
  • 2.5 免疫组化
  • 2.6 地高辛标记的Alu DNA 探针原位杂交
  • 2.7 畸胎瘤试验
  • 实验结果
  • 1 hES 细胞的体外培养、EB 形成及诱导为骨骼肌前体样细胞的形态
  • 2 不同照射剂量以及移植时间的结果分析
  • 3 hES 来源的前体细胞在小鼠体内的诱导分化
  • 3.1 hES 来源的前体细胞在 NOD/SCID 小鼠体内的诱导分化
  • 3.2 卫星细胞的鉴定
  • 3.3 hES 细胞来源的前体细胞在scid/mdx 小鼠体内的诱导分化
  • 3.4 畸胎瘤分析
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 实验试剂的配制
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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