荧光多参量显微技术研究

论文摘要

荧光光谱技术和荧光显微技术已经发展成为生物医学领域的强大工具。将荧光光谱学参数和荧光显微测量相结合既提供了高度的分子结构特异性和微环境变化信息，又提供了高的空间分辨率。生物医学发展对检测和成像系统的一个要求是在一次测量中能以很高的灵敏度和特异性得到多种功能信息。荧光光谱测量可以鉴别不同的荧光团种类；荧光寿命测量可以对荧光分子所处微环境的pH值、离子浓度(Ca2+、Na+等)、氧压等生理生化参数进行定量分析，而且对于鉴别光谱严重重叠的多组分荧光团非常有用。因此，同时光谱和时间分辨可以提供不同的对比机制和互补的功能信息，引起了人们的广泛关注。生物医学发展对检测和成像系统的另一个要求是能够无损、实时监测活体细胞的动态过程。多焦点多光子显微术（MMM）可以实现样品的三维快速多光子激发荧光显微成像，并具有对活体样品损伤小，成像深度大，图像信噪比高等优点。目前已经实现了MMM与荧光寿命测量相结合的快速成像，但时间分辨率不够高，更为突出的问题是不能给出光谱分辨信息。针对这些难以解决的问题，本论文主要完成了以下几方面的研究工作： 1．进一步阐明了与本课题密切相关的荧光显微术的理论与技术问题。 2．提出了一种两维空间同时光谱分辨技术，并讨论了两维离散点获得最佳光谱分辨率的方法。该技术实现了在一个面阵探测器上同时记录两维空间的光谱图像，扫描效率随激发点数线性提高。利用它可同时获得样品的荧光光谱和二次谐波图像。 3．参与设计和研制了一台重复频率达到1MHz、可用于两维空间探测的皮秒同步扫描相机，发展了基于扫描相机的时间分辨单／双光子激发荧光光谱技术，可同时获取样品的荧光光谱信息和寿命信息，并埘扫描相机的扫描速度、时间分辨率及非线性等进行了标定。 4．实现了一种基于同步扫描相机的两维空间同时光谱和时间分辨技术，把所获得的离散点的时间分辨光谱图像看作是在两维空间的取样值，通过对样品的三

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 荧光显微术的发展
• 1.3 荧光寿命成像显微术在生命科学中的应用
• 1.4 本论文的选题依据及主要工作
• 参考文献
• 第二章 荧光显微技术理论基础
• 2.1 引言
• 2.2 荧光光谱学物理基础
• 2.2.1 荧光
• 2.2.2 荧光寿命与量子产额
• 2.3 荧光显微术
• 2.3.1 荧光强度和光谱显微术
• 2.3.2 荧光寿命显微术
• 2.4 双光子荧光显微术
• 2.4.1 多光子荧光的产生
• 2.4.2 荧光激发
• 2.4.3 空间分辨率
• 2.4.4 穿透深度
• 2.4.5 其它考虑
• 2.5 多焦点多光子显微术
• 2.5.1 MMM的提出
• 2.5.2 MMM的发展
• 2.6 本章小结
• 参考文献
• 第三章 两维空间同时光谱分辨技术及同时光谱和时间分辨技术
• 3.1 引言
• 3.2 光谱成像技术
• 3.2.1 光谱分辨器件
• 3.2.2 光电探测器
• 3.3 两维空间同时光谱分辨技术原理
• 3.4 两维空间同时光谱分辨测量系统
• 3.5 基于同步扫描相机的同时光谱和时间分辨技术
• 3.5.1 同步扫描相机测量荧光寿命
• 3.5.2 基于同步扫描相机的时间分辨光谱技术
• 3.5.3 基于同步扫描相机的两维空间同时光谱和时间分辨技术
• 3.6 本章小结
• 参考文献
• 第四章 基于同步扫描相机的时间分辨双光子激发荧光光谱技术
• 4.1 引言
• 4.2 时间分辨双光子激发荧光光谱测量系统
• 4.2.1 光源
• 4.2.2 显微镜
• 4.2.3 皮秒同步扫描相机
• 4.2.4 CCD实时读出系统
• 4.2.5 棱镜
• 4.2.6 延时器
• 4.2.7 PIN
• 4.2.8 三维微位移系统
• 4.3 实验系统的标定
• 4.3.1 皮秒扫描相机时间分辨率标定
• 4.3.2 皮秒扫描相机扫描速度和非线性的标定
• 4.3.3 光谱标定
• 4.4 数据分析方法
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 标准荧光染料
• 4.5.2 标准荧光染料的混合溶液
• 4.5.3 生物分子荧光
• 4.5.4 生物学应用
• 4.6 本章小结
• 参考文献
• 第五章 同时光谱和时间分辨的多焦点多光子显微技术
• 5.1 引言
• 5.2 同时光谱和时间分辨的多焦点多光子显微系统
• 5.2.1 微透镜阵列
• 5.2.2 CCD实时读出系统
• 5.2.3 三维微位移系统
• 5.2.4 微机
• 5.3 SSTR-MMM系统软件
• 5.3.1 数据采集和保存
• 5.3.2 图像重构和处理
• 5.4 系统性能
• 5.4.1 激发焦点数选择
• 5.4.2 系统放大倍率
• 5.4.3 空间分辨率
• 5.4.4 光谱分辨率
• 5.5 实验结果及讨论
• 5.5.1 采样成像原理实验
• 5.5.2 荧光强度和寿命成像
• 5.5.3 深度分辨荧光强度和寿命成像
• 5.5.4 光谱分辨荧光强度和寿命成像
• 5.5.5 组织切片的光谱和寿命成像
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 总结与展望
• 6.1 本文工作总结
• 6.2 今后工作展望
• 攻读博士期间的研究成果
• 致谢