费氏中华根瘤菌HN01 nifR3基因的研究

论文摘要

费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium.fredii）HN01是一株快生型大豆根瘤菌,因其生长快,胞外多糖少,十分适合商业应用。固氮酶基因（nif基因）在根瘤菌固氮中起着重要的作用,本文利用自杀质粒诱变的方法对费氏中华根瘤菌HN01的固氮酶基因nifR3在结瘤、固氮中的作用进行了研究,并对其上游序列P1的启动子活性进行了测定。我们依据根瘤菌属和中华根瘤菌属的nifR3家族保守序列设计引物,以费氏中华根瘤菌HN01的质粒为模版扩增,对其测序,获得一个完整的ORF,长1014bp,与Sinorhizobium medicae 1021的nifR3的序列在核苷酸水平上有80%的同源性,在氨基酸上有83%的同源性,命名为nifR3。同时得到其上游一段长286 bp的序列P1,在网上预测P1是启动子的最高得值为0.94。将启动子疑似序列P1连接表达载体pLARF6-GUS,获得融合质粒pLARF6—GUSP1,以测定P1的启动子活性。利用β-Glucuronidase对P1进行了启动子活性测定。结果表明,长280 bp的P1序列具有启动子活性。利用pK18mob构建nifR3基因的突变质粒,经三亲本接合导入HN01,获得突变菌株HNR33。通过PCR扩增,得到含有完整nifR3的片段,连接到表达载体pLAFR3上,获得互补质粒pHNBR3。以互补质粒为供体,通过三亲本接合导入突变株HNR33,获得互补株HNBR3。通过对出发菌株HN01、突变体HNR33和互补菌株HNBR3进行生长影响的测试,发现都能正常生长在完全培养基上,达到稳定期的时间大概为30小时。当分别以硝酸盐和铵盐为唯一氮源时,突变体的生长状况与出发菌株的生长情况相似,说明nifR3基因对不同氮源利用的影响不大。通过植株试验,发现HNR33完全现瘤时间比出发菌株HN01晚1天,平均瘤重比HN01少0.082克,平均瘤数比HN01少4个,固氮酶酶活性也比野生菌株HN01的低。这表明nifR3基因与HN01的结瘤效率和固氮酶活性有关,并对结瘤有影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物固氮的意义
• 1.2 生物固氮简介
• 1.3 共生固氮的分子遗传研究进展
• 1.3.1 结瘤基因
• 1.3.2 固氮基因
• 1.3.3 基因组研究
• 1.4 与固氮相关基因克隆的主要实验技术
• 1.4.1 克隆与固氮有关基因的方法
• 1.4.2 鉴定与固氮相关基因克隆的主要实验技术
• 1.5 根瘤菌竞争结瘤的分子遗传研究进展
• 1.6 启动子的研究概况
• 1.6.1 启动子的结构
• 1.6.2 启动子的分类
• 1.6.3 启动子克隆的方法
• 1.6.4 启动子的研究方法
• 1.7 本实验的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 植物材料
• 2.3 培养基及生长条件
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 生长条件
• 2.3.3 菌种保存
• 2.4 抗菌素
• 2.5 溶液、缓冲液和试剂
• 2.6 质粒DNA的制备
• 2.6.1 碱变性法提取质粒DNA
• 2.6.2 大量制备质粒DNA
• 2.6.3 试剂盒快速小量提取质粒
• 2.6.4 质粒DNA的纯化、定量与沉淀
• 2.6.4.1 酚/氯仿抽提
• 2.6.4.2 质粒DNA的沉淀与贮存
• 2.6.4.3 分光光度法测定DNA浓度
• 2.7 电泳
• 2.8 DNA酶切
• 2.8.1 DNA的限制性内切酶酶切
• 2.9 DNA酶切片段的分离与回收
• 2.9.1 透析袋电泳法分离回收DNA片段
• 2.9.2 试剂盒法回收 DNA片段
• 2.10 DNA的连接
• 2.11 质粒DNA的转化
• 2.11.1 快速制备E.coli的感受态细胞
• 2.11.2 转化反应
• 2.12 PCR扩增 DNA片段
• 2.13 根瘤菌总 DNA的提取
• 2.13.1 快速提取
• 2.13.2 根瘤菌总DNA的大量提取
• 2.14 三亲本接合
• 2.15 根瘤菌生长曲线的测定
• 2.16 大豆水培试验方法
• 2.16.1 供试菌株
• 2.16.2 植物材料
• 2.16.3 大豆水培试验
• 2.16.4 实验处理
• 2.16.5 结瘤时间观察
• 2.16.6 共生固氮效应的测定
• 2.17 GUS活性的检测
• 2.17.1 片段启动子活性的定性检测
• 2.17.2 GUS（β-Glucuronidase）活性的定量测定
• 2.18 数据统计
• 第三章 序列分析及启动子的活性测定
• 3.1 ORF的DNA序列分析
• 3.2 nifR3上游序列分析
• 3.3 启动子目的片段的获得
• 3.4 结合子的获得
• 3.5 P1序列启动子活性的定性检测
• 3.6 P1序列启动子gus活性的定量测定
• 3.7 小结
• 第四章 费氏中华根瘤菌HN01 nifR3基因突变体及互补体的构建
• 4.1 pK18mob（pknockout vector）单交换重组质粒构建
• 4.1.1 nifR3基因部分片段的克隆
• 4.1.2 载体的酶切、连接、转化
• 4.1.3 连入片段方向验证
• 4.2 同源单交换构建突变体
• 4.2.1 通过三亲本结合及突变体筛选
• 4.2.2 突变体的验证
• 4.3 互补菌株的构建
• 4.3.1 互补菌株的获得
• 4.4 小结
• 第五章 费氏中华根瘤菌HN01突变及互补株的生长情况和植株结瘤试验
• 5.1 菌株生长情况的测定
• 5.1.1 完全培养基中的生长情况
• 5.1.2 基本培养基中的生长状况
• 5.2 植株的单独结瘤效应及固氮效率
• 5.3 小结
• 第六章 总结
• 6.1 实验总结
• 6.2 后续工作
• 参考文献
• 致谢