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构建反义双价TuMV-Nib和LFY基因植物表达载体转春大白菜研究

2020-12-03阅读(764)

构建反义双价TuMV-Nib和LFY基因植物表达载体转春大白菜研究

论文摘要

大白菜虽是原产我国的重要蔬菜作物,但春大白菜育种国内起步较晚,生产上大多使用从日本、韩国进口的种子。虽有一定的耐抽薹,但不抗病毒病。在大白菜生产中,先期抽薹和后期病毒病重已经成为亟待解决的问题。采用常规育种方法培育耐抽薹、抗病毒大白菜品种年限长、效率低。因此,结合常规育种方法,采用基因工程技术克隆相关基因,控制植物的开花和病毒的复制,创新大白菜抗病毒、耐抽薹种质材料,进而育成具有自主知识产权的商品性好、抗病毒病、冬性较强不易抽薹的春大白菜育种材料和品种,打破国内春大白菜种子依靠进口的局面,均具有重要经济价值和现实意义。本研究以中国春大白菜为材料,在采用RT-PCR技术克隆的TuMV-NIb、LFY基因的基础上,构建成反义双价基因的植物表达载体,利用TuMV-NIb基因的目的是抵抗芜菁花叶病毒,LFY基因的目的是延迟植物的开花时间。通过遗传转化研究,建立了大白菜遗传转化系统,为利用TuMV-NIb与LFY双价基因,抵抗大白菜芜菁花叶病毒和抑制抽薹奠定基础,培育抗病毒和耐抽薹春大白菜新种质。并获得了转TuMV-NIb、LFY基因的阳性植株。主要研究结果如下:1.近几年来,TuMV不同株系的核苷酸序列得到测定。病毒复制相关蛋白基因转入烟草发现,对TuMV有极强的抗性。LFY基因处于成花相关基因调控网络的关键位置,属于开花决定基因。通过基因工程手段控制花发育或开花时间基因的表达,可改变受体植物的花期,直接控制作物生育期。利用克隆的TuMV-NIb、LFY基因,通过酶切、连接、转化,重组质粒的PCR扩增、酶切鉴定,构建成双价反义基因的植物表达载体;采用冻融法转化农杆菌LBA4404,获得了工程菌株。2.研究了基因型、激素配比等影响大白菜再生的限制因素,确定了以“青3福山”大白菜带柄子叶为外植体的分化培养基为:MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+AgNO34mg/L;在25℃,16/8hr（光/暗）下培养,不定芽的分化频率均在85%以上3.完善了农杆菌介导的大白菜叶盘法遗传转化体系,确定了菌液浸染浓度为6.0,浸染5min;卡那霉素适宜筛选压力为10mg/L。获得的转化条件是:带柄子叶外植体预培养2-3d,农杆菌浸染外植体5min;共培养时间为2～3d,经过7～10d恢复培养,4～6周的选择培养后转到生根培养基上生根。最终在“青3福山”大白菜上获得了5株抗性植株,得到经PCR检测阳性株转化率为3.3‰。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 研究目的意义
  • 1.2 大白菜转基因技术研究进展
  • 1.2.1 大白菜遗传转化体系的建立
  • 1.2.2 农杆菌介导的转基因方法简介
  • 1.3 关于芜菁花叶病毒病（TuMV）的研究
  • 1.3.1 芜菁花叶病毒分子生物学研究
  • 1.3.2 芸薹属寄主的TuMV抗性基因
  • 1.3.3 白菜类转TuMV的转基因研究
  • 1.4 大白菜晚抽薹育种研究进展
  • 1.5 控制成花基因——LFY基因的研究
  • 1.5.1 LFY基因的结构
  • 1.5.2 LFY基因的功能
  • 1.5.3 LFY基因的表达
  • 1.5.4 大白菜中LFY基因的应用
  • 1.6 双价基因表达载体构建
  • 1.7 存在技术问题与植物安全性问题
  • 1.7.1 存在技术问题
  • 1.7.2 植物安全性问题
  • 1.8 研究内容
  • 第二章 TuMV-Nib和LFY反义双价基因植物表达载体构建
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌株和载体
  • 2.1.2 培养基
  • 2.1.3 酶和试剂
  • 2.2 TuMV-Nib、LFY反义双价基因植物表达载体构建
  • 2-LFY表达载体构建'>2.2.1 pROK2-LFY表达载体构建
  • 2.2.2 TuMV-Nib、LFY反义双价基因表达载体的构建
  • 2.3 结果与分析
  • 2-LFY载体构建结果'>2.3.1 pROK2-LFY载体构建结果
  • 2-TuMV-Nib+LFY反义双价植物表达载体构建'>2.3.2 pROK2-TuMV-Nib+LFY反义双价植物表达载体构建
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 TuMV-Nib和LFY反义双价植物表达载体构建
  • 第三章 转化春大白菜青3福山自交系再生体系的研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 实验植物材料
  • 3.1.2 组织培养方法
  • 3.1.3 遗传转化所用的植物材料、菌株
  • 3.1.4 农杆菌介导的叶盘转化法
  • 2-TuMV-Nib+LFY双价反义基因大白菜分子鉴定'>3.1.5 转pROK2-TuMV-Nib+LFY双价反义基因大白菜分子鉴定
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 不同基因型的离体培养差异
  • 3.2.2 激素组成及配比对子叶离体培养的影响
  • 3.2.3 幼苗生根及驯化移栽
  • 3.2.4 菌液浓度及浸染时间对基因转化的影响
  • 3.2.5 不同选择压力对大白菜转化双价基因的影响
  • 3.2.6 转反义双价基因PCR检测结果
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 不同基因型的离体培养差异
  • 3.3.2 激素种类及配比对大白菜离体再生的影响
  • 3.3.3 选择压对大白菜转化影响
  • 3.4 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 个人简历

    • 相关论文文献

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    • [2].光皮桦LFY同源基因的克隆及表达分析[J]. 园艺学报 2015(08)
    • [3].甘蓝LFY基因的克隆及序列分析[J]. 中国蔬菜 2011(04)
    • [4].早熟油菜成花相关基因LFY的克隆与分析[J]. 西北植物学报 2012(10)
    • [5].锥栗总RNA提取方法比较及LFY基因克隆[J]. 热带作物学报 2014(09)
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    • [7].胡桃楸成花相关LFY同源基因的克隆和序列分析[J]. 分子植物育种 2017(07)
    • [8].新疆早实核桃LFY同源基因的克隆与分析[J]. 西北农业学报 2012(11)
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    • [10].枇杷LFY同源基因植物表达载体构建及其功能分析[J]. 果树学报 2008(05)
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    • [12].草莓LFY同源基因的克隆及其表达分析[J]. 园艺学报 2012(05)
    • [13].芥菜LFY同源基因克隆及序列分析[J]. 西南大学学报(自然科学版) 2009(04)
    • [14].LEAFY(LFY)基因在花发育网络调控中的研究进展[J]. 现代农业科技 2012(09)
    • [15].根癌农杆菌介导LFY基因转化苹果的研究[J]. 江西农业学报 2008(06)
    • [16].拟南芥成花调控LFY基因的选择性剪接(英文)[J]. 广西植物 2012(03)

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