生物发酵床垫料的细菌学调查及主要病原菌分子检测方法建立

论文摘要

自南方地区推广生物发酵床养殖技术以来,由于该养殖模式并非完全适宜于当地气候条件,生物发酵床垫料中细菌分布、发酵后能否减少或消除生猪排泄物中病原菌的种类和数量成为关注的焦点。为了评估生物发酵床技术能否适合四川地区养猪,本试验对生物发酵床垫料中细菌类别、病原菌种类及病原菌的检测方法等方面进行了研究。本实验采集不同传统养殖场仔猪、保育猪、育肥猪三个年龄段不同猪粪样品45份以及对应的产仔舍、保育舍、育肥舍发酵床垫料样品45份,对所分离细菌进行生化鉴定、16SrDNA分子鉴定和致病性实验,确定细菌类型和致病菌种类,进行致病菌的药敏实验。同时,针对大肠杆菌两种主要致病性毒素基因,产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素基因LT与产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素基因Stx2e,设计合成两对特异性检测引物,建立特异的二重PCR,检测分离菌中有无致病性大肠杆菌存在,结果如下：1、菌群分析显示：粪便与发酵床垫料的细菌种类大致相同,主要为大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等,发酵床垫料中还含有一种粘液性芽孢杆菌；发酵床垫料与粪便中的大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌含量差异不显著（P>0.05）,而垫料中沙门氏菌和枯草芽孢杆菌数含量均显著高于粪便（P<0.05）、粘液性芽孢杆菌含量极显著高于粪便（P<0.01）。粪便中各细菌的含量为：仔猪、保育猪和育肥猪粪便中大肠杆菌总数分别为1.6×106cfu/g、7.0×105cfu/g和1.3×106cfu/g;粪便中链球菌分别为2×104cfu/g、2×105cfu/g和2×105cfu/g;所有年龄猪粪便中葡萄球菌的总数维持在2×104cfu/g,以灰白色葡萄球菌为主,金黄色葡萄球菌则维持在较低水平。此外,还可分离到少量的沙门氏菌及空气中常见芽孢杆菌,粪便中这两种细菌总数在2×102cfu/g。发酵床垫料中大肠杆菌含量为：产仔舍为4×106cfu/g,保育舍为1.6×106cfu/g,育肥舍为2×106cfu/g,均极显著高于各年龄段粪便（P<0.01）。发酵床垫料中葡萄球菌含量均维持在1.0×106cfu/g,产仔舍达到2×107cfu/g,均极显著高于各年龄段粪便（P<0.01）,以灰白色葡萄球菌为主；金黄色葡萄球菌所占比例较粪便有所升高；链球菌的浓度维持在4×104cfu/g,均极显著低于粪便（P<0.01）；发酵床垫料中粘液性芽孢杆菌的含量极高,均维持在2×106cfu/g,粪便中几乎未分离到此类菌。2、致病性实验证实,分离菌株分别以0.5ml（5×108cfu/mL）注射小鼠,发现粪便和垫料中大肠杆菌、沙门氏菌均能致死小鼠,致死率为100%；粪便中灰白色葡萄球菌的致死情况与相应的猪舍相似,但仔猪粪便中分离的菌株对小鼠的致死率为50%,而产仔舍为0%；分离的芽孢杆菌对小鼠均不具有致死性。3、药敏实验显示,所有病原菌均存在不同程度耐药性。大肠杆菌对菌必治、头孢吡肟等敏感；沙门氏菌对菌必治、头孢吡肟极敏感,对丁胺卡拉、恩诺沙星等敏感；金黄色葡萄球菌对菌必治、头孢吡肟等敏感；链球菌对复方新诺明极敏感,对菌必治、头孢吡肟等敏感,对庆大霉素、阿莫西林等中度敏感。4、建立了准确快速的细菌16S rDNA降落PCR分子检测方法,并以该方法对发酵床中分离的主要细菌进行了检测,大肠杆菌SC-E株与大肠杆菌ATCC43895株的同源性为99.5%,沙门氏菌SC-S株与沙门氏菌（登录号：AF227869）的同源性为98.4%,金葡菌SC-sa株与金黄色葡萄球菌（登录号：DQ997837）的同源性为99.8%,链球菌SC-ss株与猪链球菌（登录号：AF009487）的同源性为99.8%。粘液性芽孢杆菌SC-B株与产淀粉酶枯草芽孢杆菌的同源性在99.2～99.7%,从而证实该方法的准确性很高。5、建立了基于大肠杆菌两种主要致病性毒素基因LT与Stx2e的二重PCR检测方法,该方法具有特异性好、灵敏度高、简便快速等优点,可用于临床检测致病性大肠杆菌。用该方法对产仔舍垫料和仔猪粪便各分离的15株大肠杆菌进行检测,粪便中共检测出2株产肠毒素大肠杆菌,产仔舍垫料中未检测出产肠毒素大肠杆菌,产志贺毒素大肠杆菌则均未检出。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 生物发酵床养猪技术
• 1.1 概念
• 1.2 生物发酵床养猪技术的理论基础
• 1.3 生物发酵床养猪技术的研究进展及推广应用
• 2 生物发酵床养猪技术存在问题
• 2.1 垫料资源分布不均匀
• 2.2 猪只越夏成为问题
• 2.3 难以使用消毒药品和贯彻全进全出制度
• 2.4 疫病控制风险较大
• 3 发酵床病原菌研究现状
• 3.1 微生物分离种类
• 3.2 分离病原菌耐药性研究
• 3.3 分离病原菌致病性研究
• 3.4 产生病原菌原因
• 4 细菌鉴定方法与分子克隆
• 5 目的意义
• 第一章 生物发酵床垫料的细菌学分析
• 1 实验材料
• 1.1 主要试剂及培养基
• 1.2 实验动物
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 样品采集与保存
• 2.2 发酵床垫料与猪粪便细菌分离
• 2.3 发酵床垫料与猪粪便中细菌浓度分析
• 2.4 小鼠致死性实验
• 2.5 细菌生化鉴定
• 2.6 主要病原菌药物敏感性实验
• 3 实验结果
• 3.1 健康猪粪便与发酵床垫料细菌分离
• 3.2 不同年龄猪舍发酵床与猪粪便细菌含量分析
• 3.3 小鼠致病性实验
• 3.4 细菌生化鉴定
• 3.5 病原菌耐药性分析
• 4 讨论
• 4.1 发酵床垫料与猪粪便中细菌种类与数量区系对比分析
• 4.2 发酵床养猪模式的研究趋势
• 第二章 细菌16S RDNA降落PCR检测方法的建立
• 1 实验材料
• 1.1 主要培养基
• 1.2 主要试剂与菌种
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 不同细菌基因组模板的制备
• 2.3 细菌16S基因PCR扩增条件优化
• 2.4 目的条带回收
• 2.5 感受态细胞制备
• 2.6 连接与转化
• 2.7 重组质粒的筛选
• 2.8 序列测定与分析
• 3 实验结果
• 3.1 退火温度对细菌16s基因PCR的影响
• 3.2 引物浓度对PCR的影响
• 3.3 模板浓度对PCR的影响
• 3.4 发酵床垫料中主要细菌16S rDNA PCR扩增结果
• 3.5 不同细菌16S rDNA克隆测序
• 3.6 基于16S基因的进化分析
• 4 讨论
• 4.1 微生物的分类鉴定方法比较分析
• 4.2 16S基因的PCR条件优化结果分析
• 4.3 16s基因的克隆及测序结果分析
• 第三章 致病性大肠杆菌不耐热肠毒素与志贺毒素二重PCR检测方法的建立
• 1 实验材料
• 1.1 实验菌种与主要培养基
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验器材
• 2 实验方法
• 2.1 设计合成PCR检测引物
• 2.2 细菌菌种活化与DNA模板制备
• 2.3 分别进行单一PCR并优化PCR条件
• 2.4 PCR产物克隆测序
• 2.5 二重PCR条件优化
• 2.6 使用建立二重PCR体系进行临床样本检测
• 3 实验结果
• 3.1 退火温度对PCR的影响
• 3.2 模板与引物浓度对单一PCR的影响
• 3.3 PCR产物克隆测序
• 3.4 二重PCR条件优化与特异性实验
• 3.5 临床样本检测结果
• 4 讨论
• 4.1 大肠杆菌在仔猪腹泻症状中扮演着重要角色
• 4.2 大肠杆菌在仔猪腹泻症状中扮演着重要角色
• 4.3 致病性大肠杆菌的实验室诊断方法比较
• 4.4 致病性大肠杆菌二重PCR检测方法的效果分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢