以PPARγ/RXRα为靶点治疗多发性骨髓瘤的实验研究

论文摘要

一、PPARγ配体罗格列酮与全反式维甲酸对骨髓瘤细胞株生长和调亡的影响及其机制的研究目的观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferators activated receptors ,PPARγ）的人工配体罗格列酮（rosiglitazone,RGZ）与全反式维甲酸（ATRA）在体外对骨髓瘤细胞生长和凋亡的影响并进一步研究其可能的作用机制。方法人骨髓瘤细胞U266和RPMI-8226以RGZ、ATRA干预后,采用3H-TdR掺入法检测细胞增殖变化;MTT法检测细胞活力变化;Annexin-V/PI双染和TUNEL方法检测细胞凋亡的变化;用半定量RT-PCR方法检测凋亡抑制蛋白FLIP、XIAP及survivin mRNA表达变化;采用荧光CaspACE?试剂盒检测caspas-3活性变化。结果RGZ对骨髓瘤细胞的增殖抑制作用与RGZ的剂量直线相关（U266组r2= 0.991, p<0.01;RPMI8226组r2= 0.961, p<0.01）,与RGZ单用组比较,ATRA与RGZ联合对骨髓瘤细胞的增殖抑制作用更明显（U266组p<0.001;RPMI8226组p<0.01）;用MTT法检测细胞活力变化时观察到,RGZ对骨髓瘤细胞的活力产生了相似的抑制作用,并呈剂量、时间依赖性,ATRA与RGZ联合应用时能显著增强RGZ对骨髓瘤细胞活力抑制作用（p<0.01）;TUNEL标记后荧光显微镜下观察到,用5μmol/LRGZ处理后,U266细胞内即出现绿色荧光斑点,凋亡指数为（10.4±2.6）%。随着RGZ浓度的增加,凋亡指数也增加,以10μmol/L的RGZ培养48h后能诱导（28.6±7.7）%的U266细胞发生凋亡,而在ATRA单独培养组,未观察到显著的绿色荧光斑点,培养液中联合加入RGZ和ATRA后,凋亡细胞的比例较相应的RGZ单独处理组明显升高（p值均<0.05）;Annexin-V/PI双染后流式细胞仪检测也证实RGZ能诱导U266细胞和RPMI8226细胞发生凋亡,且诱导凋亡作用呈时间、剂量依赖性,ATRA与RGZ联合应用时,凋亡细胞的比例较相应的RGZ单独处理组显著升高（p值均<0.01）;RT-PCR方法检测显示,RGZ能抑制FLIP、XIAP及survivin mRNA的表达,ATRA能协同RGZ进一步抑制FLIP、XIAP及survivin的mRNA的表达;经RGZ处理骨髓瘤细胞的caspase-3活性显著增加,RGZ与ATRA联合处理后caspase-3活性较RGZ处理组显著增加（p<0.01）。结论RGZ能通过抑制FLIP、XIAP及survivin的表达、促进caspas-3的活化从而诱导细胞凋亡、抑制骨髓瘤细胞的增殖和生长。ATRA能增强RGZ对骨髓瘤细胞的上述作用,两者联合具有协同效应。二、RGZ与ATRA对骨髓瘤细胞分化的影响及其机制的研究目的研究过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferators activated receptorγ,PPARγ）的配体罗格列酮（RGZ）与全反式维甲酸（ATRA）对骨髓瘤细胞分化的影响及其可能机制。方法人骨髓瘤细胞U266和RPMI-8226以RGZ、ATRA干预后,用PI染色分析细胞周期变化;瑞氏-姬母萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析CD49e表达变化;用N Antisera to Human Immunoglobulin/L-Chains试剂盒检测培养上清中轻链的含量,Western blot方法检测p27Kip1、p21Waf1表达变化。结果经RGZ培养后,骨髓瘤细胞的G0/G1期比例较对照组显著增加（p<0.05）,G2/M和S期细胞的比例则相应减少（p<0.05）,ATRA与RGZ联合应用使细胞周期停滞的作用更加显著（p<0.01）;经RGZ处理后,骨髓瘤细胞表面CD49e的表达率增加,形态学变化也符合骨髓瘤细胞分化成熟的规律,RGZ与ATRA的联合应用能使骨髓瘤细胞分化成熟的形态学变化和CD49e的表达增加更加明显;与对照组相比,U266细胞与RPMI-8226细胞经ATRA培养后,蛋白的的分泌量无显著增加。以RGZ培养后,U266细胞与RPMI-8226细胞的培养上清中轻链蛋白的浓度分别达到（548.3±28.1）ng/ml和（378.4±25.6）ng/ml,较对照组均显著增加（p值均<0.05）,在培养液中同时加入ATRA与RGZ后,培养上清中轻链蛋白的含量较RGZ单独处理组增加更为明显（U266细胞组p<0.01,RPMI-8226细胞组p<0.05）。经RGZ培养72小时后,骨髓瘤细胞的p27Kip1、p21Waf1蛋白的表达量均较对照组明显增加,ATRA与RGZ联合应用时,p27Kip1、p21Waf1的表达量较RGZ处理组的表达增加更加明显。结论RGZ可能通过上调p27Kip1、p21Waf1蛋白的表达介导骨髓瘤细胞的周期停滞并诱导骨髓瘤细胞分化、抑制骨髓瘤细胞增殖。ATRA能增强RGZ对骨髓瘤细胞的上述作用,两者联合具有协同效应。三、罗格列酮与全反式维甲酸对原代骨髓瘤细胞凋亡和分化的影响目的观察RGZ及ATRA对骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞的影响。方法采用Mini MRCS系统（Miltemyi Biotec,德国）阳性分离纯化法分离5例初治MM患者骨髓中CD138+细胞。获得的CD138+细胞经RGZ、RGZ+ATRA处理后用MTT法检测细胞的增殖和活性、瑞氏-姬母萨染色观察细胞形态学变化、用Annexin V-FITC/PI标记检测细胞凋亡变化、CD49e-FITC单抗标记细胞表面分化抗原CD49e检测、用N Antisera to Human Immunoglobulin/L-Chains试剂盒检测各样本中κ及λ轻链的含量。结果原代骨髓瘤细胞经10μmol/L RGZ培养48后,细胞的活力为66.3%,较对照组显著降低（p<0.01）。原代骨髓瘤细胞经1μmol/L ATRA培养后,细胞的活力为87.5%,较对照组降低,但差异无显著性（p>0.05）。当1μmol/L ATRA与10μmol/L RGZ联合应用时,RGZ能显著增强RGZ对骨髓瘤细胞活力的抑制作用;原代骨髓瘤细胞以1μmol/L ATRA单独培养72小时后,骨髓瘤细胞在形态上仍比较原始,较对照组无明显改变,经10μmol/L RGZ处理的原代骨髓瘤细胞在形态上出现了分化和凋亡的改变,当ATRA与RGZ联合应用时,类似的形态学改变更加明显;5例患者的原代骨髓瘤细胞经1μmol/L ATRA培养48小时后,细胞凋亡的比例较对照组差异无显著性（p>0.05）,经10μmol/L RGZ培养48h后,发生凋亡的比例较对照组明显增加（p<0.05,31.6±5.7% vs 10.2±2.7%）,在培养液中联合加入ATRA后,凋亡细胞的比例较相应的RGZ单独处理组明显升高,达58.4±11.2%（p<0.05）;ATRA对原代骨髓瘤细胞表面的CD49e表达较对照组无明显增加,以10μM RGZ培养72小时后,原代骨髓瘤细胞表面CD49e的表达率为（14.3±3.2）%,较对照组均明显上调（p < 0.05）,ATRA与RGZ联合使用时,原代骨髓瘤细胞CD49e表达率的增加较RGZ单独处理组更加显著,达（24.7±5.7）%（p < 0.05）;5位初治患者的原代骨髓瘤细胞以1μmol/L ATRA培养后,原代骨髓瘤细胞上清中免疫球蛋白轻链含量较对照组无明显增加,以10μmol/L RGZ培养后,原代骨髓瘤细胞的培养上清中免疫球蛋白轻链含量均较对照组均明显上调,ATRA与RGZ联合使用时,有4位患者（4/5）的原代骨髓瘤细胞培养上清中的免疫球蛋白轻链含量较RGZ单独处理组更加显著。结论RGZ能激活原代骨髓瘤细胞的PPARγ受体,通过诱导原代骨髓瘤细胞分化、成熟和凋亡,抑制原代骨髓瘤细胞的生长和增殖,并且在诱导原代骨髓瘤细胞分化和凋亡的过程中,ATRA与RGZ也具有协同效应。四、罗格列酮与全反式维甲酸对多发性骨髓瘤血管形成及移植瘤生长的影响目的了解RGZ和ATRA对骨髓瘤细胞在裸鼠体内生长的影响及并观察RGZ、ATRA对多发性骨髓瘤VEGF表达、移植瘤血管形成的影响。方法U266、RPMI-8226细胞以RGZ、ATRA干预后,用半定量RT-PCR方法分析VEGF的表达变化;在4周龄Balb/C裸鼠的一侧肩胛部皮下接种0.1ml密度为1×108/ml的U266细胞,接种一周后分别以RGZ、ATRA腹腔注射干预,各组连续给药21d,第21d脱颈处死裸鼠,剥离皮下肿瘤并称量;将剥离肿瘤置于10%的中性福尔马林中固定24h,石蜡包埋、切片,分别作H-E染色和CD34和VEGF免疫组化染色。结果半定量RT-PCR检测结果显示,骨髓瘤细胞系U266与RPMI-8226细胞均有VEGFmRNA高表达,U266与RPMI-8226细胞在经5μmol/L RGZ处理24小时后,VEGF的mRNA的表达水平均下调。当RGZ浓度的增加至10μmol/L时,VEGF的mRNA的表达水平下调更加明显,RGZ与ATRA的联合应用时,VEGFmRNA的表达水平较相应的RGZ处理组更加低下;U266细胞接种后在裸鼠皮下均成瘤,腹腔用药后,RGZ可明显抑制骨髓瘤细胞在裸鼠体内的生长,RGZ处理组的移植瘤的体积和重量分别为785±262mm3和1748±365mg,均显著低于对照组（p<0.01）,并且ATRA与RGZ联合能增强RGZ在裸鼠体内对骨髓瘤细胞生长的抑制作用,联合处理组的移植瘤的体积和重量分别仅为154±89mm3和626±102mg（p<0.01 versus RGZ组）;HE染色显示对照组移植瘤组织内瘤细胞排列密集,间质最为丰富,血管生成最多,具有丰富的吻合,RGZ处理组瘤细胞密度降低、血管生成相对较少,以RGZ与ATRA联合用药组的血管生成最少;免疫组化显示各组移植瘤中均有VEGF蛋白的表达,以对照组的VEGF蛋白表达最强,呈棕褐色,IS为2.2±0.40。RGZ作用组VEGF表达显著下降,呈棕黄色,IS为1.48±0.37 （p<0.05）。ATRA+RGZ联合处理后,移植瘤的VEGF表达下调更明显,IS为0.58±0.26,较RGZ处理组也显著下降（p<0.01）;各组移植瘤中均有CD34表达,以对照组的CD34表达最强,微血管计数最高,MVD为56.4±15.2。RGZ处理组的CD34表达次之,微血管计数较对照组减少,MVD为44.6±11.2 （P<0.05）。RGZ与ATRA联合用药组的CD34表达最弱,微血管计数也最少,MVD为21.5±8.6 （P<0.05）。结论RGZ及ATRA在体内环境中也能发挥抑制骨髓瘤细胞增殖和生长的作用。除了通过诱导骨髓瘤细胞分化和凋亡抑制骨髓瘤细胞的生长和增殖之外,通过抑制骨髓瘤细胞VEGF的表达从而阻断血管形成也是其抗肿瘤作用的重要机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 罗格列酮与全反式维甲酸对骨髓瘤细胞株生长和调亡的影响及其可能机制的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 罗格列酮与全反式维甲酸对骨髓瘤细胞分化的影响及其可能机制的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 罗格列酮与全反式维甲酸对原代骨髓瘤细胞凋亡和分化的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 罗格列酮与全反式维甲酸对多发性骨髓瘤血管形成及移植瘤生长的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述：PPARΓ及其配体在血液肿瘤中的研究进展
• 缩略词表
• 攻读学位期间完成的文章、参加的学术会议及获得的资助
• 致谢