根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的多年生黑麦草（Lolium perenne L.）遗传转化

论文摘要

多年生黑麦草(Lolium perenne L．)是优良的牧草和草坪草，是畜牧业和草坪业重要的产业支柱。由于自交不亲和，传统遗传改良困难而复杂。生物技术尤其是转基因技术对其遗传改良带来希望。本研究通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，对多年生黑麦草进行遗传转化，成功地将外源报告基因或目的基因导入至多年生黑麦草中，获得转基因植株。研究首先对多年生黑麦草的转化条件进行了优化，建立起根癌农杆菌介导的遗传转化方法。在选择的9种多年生黑麦草成熟胚诱导的愈伤组织中，经用根癌农杆菌侵染、百龙霉素选择，从4种多年生黑麦草材料(金牌美达丽、神枪手、多福和利美斯)中获得了抗性愈伤组织和抗性植株。在利用报告基因进行转化中，金牌美达丽、神枪手、多福的抗性植株是由携质粒pCAMBIA2301的农杆菌EHA105转化后获得的。该质粒含有选择基因npt Ⅱ和报告基因gus，均由CaMV35S启动子驱动。经PCR、GUS组织染色验证结果表明，绝大多数抗性植株是转npt Ⅱ和gus基因的植株。其中金牌美达丽从1次转化中获得9株转基因植株：神枪手从2次转化中分别获得4和12苗；从3次转化中分别获得转基因多福植株17、18和15苗。最高转化效率可以达到4.3％。烟草汁在一定程度上有提高转化效率的作用。以质粒pCAMBIA2301为模板进行探针PCR地高辛标记，Southern bloting分析金牌美达丽9株转基因植株npt Ⅱ基因，结果表明，转基因植株外源基因拷贝数低，其中6株为单拷贝，

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摘要

Abstract

第一章根癌农杆菌介导的多年生黑麦草转化方法的建立

摘要

1.引言

2 材料和方法

2.1 试剂和缓冲液

2.2 菌株和载体

2.3 植物材料

2.4 培养基

2.4.1 细菌培养基

2.4.2 植物培养基

2.5 方法

2.5.1 质粒或连接产物转化大肠杆菌E.coli

2.5.2 大肠杆菌质粒DNA的提取

2.5.3 质粒转化农杆菌

2.5.4 愈伤组织的诱导、继代和分化培养

2.5.5 根癌农杆菌的培养

2.6 转化理化条件的确立

2.6.1 愈伤组织的选取

2.6.2 选择剂及选择压

2.6.3 转化共培养时间

2.6.4 菌株的选择

2.6.5 除菌恢复培养

2.6.6 质粒的选用

3.结果

3.1 质粒转化农杆菌

3.2 愈伤组织的诱导、分化及再生

3.3 转化条件的优化

3.3.1 菌株的选择

3.3.2 选择剂及选择压的确立

3.3.3 质粒的选择

3.3.4 转化共培养时间的选择

3.3.5 除菌恢复培养时间

4.讨论

4.1 质粒转化根癌农杆菌方法的选择

4.2 影响农杆菌介导的植物转化因素

4.1.1 材料的选取

4.2.2 愈伤组织的诱导和植株再生

4.2.3 农杆菌菌株的选择

4.2.4 选择剂、选择压和质粒的选择

4.2.5 脱菌无选择培养

小结

参考文献

第二章多年生黑麦草（Lolium.perenne L.）遗传转化及转基因植株鉴定

摘要

1.引言

2.材料和方法

2.1 质粒及菌株

2.2 植物材料

2.3 培养基

2.4 植物组织培养

2.4.1 多年生黑麦草愈伤组织诱导培养

2.4.2 烟草无菌苗的培养

2.5 转化方法

2.5.1 转化程序

2.5.1 转化技术路线

2.6 转化子鉴定

2.6.1 绿色荧光蛋白检测

2.6.2 GUS组织化学显色反应

2.6.3 PCR检测

2.6.4 Southern-bloting检测

2.6.5 Western-bloting检测

3.结果

3.1 转化子筛选和转基因植株的获得

3.2 转化子鉴定

3.2.1 GUS组织染色

3.2.2 GFP荧光体视显微镜检测

3.2.3 PCR检测

3.2.4 Southern-bloting分析

图2.16 转基因金牌美达丽植株的Southern-bloting分析

3.2.5 Western-bloting分析

3.3 转基因多年生黑麦草结果统计分析

4.讨论

4.1 转化方法的建立

4.2 报告基因gus和gfp

4.3 烟草汁及乙酰丁香酮对转化效率的影响

4.4 报告基因的启动子对转化效率的影响

4.5 转基因多年生黑麦草植株的分子鉴定

4.6 转基因植株外源基因的整合位点

小结

参考文献

第三章转基因多年生黑麦草植株T-DNA侧翼序列分析

摘要

1.引言

2.材料和方法

2.1 植物总DNA提取

2.2 Cassette-ligation-mediated PCR扩增T-DNA侧翼序列

2.2.1 Cassette接头及引物合成

2.2.2 DNA的限制性内切酶酶切反应

2.2.3 Cassette-DNA连接反应

2.2.4 PCR扩增

2.3 PCR片段克隆和测序

3.结果

3.1 特异引物设计

3.2 侧翼序列克隆及测序

3.3 T-DNA左侧翼序列分析

4.讨论

4.1 未知侧翼序列扩增技术

4.2 插入T-DNA边界序列分析

4.3 插入基因组位点的分析

4.4 T-DNA插入突变体在功能基因组研究中的应用

小结

参考文献

第四章逆境诱导表达转录因子导入多年生黑麦草（Lolium perenne L.）研究

摘要

1.引言

2.材料和方法

2.1 材料和试剂

2.2 方法

2.2.1 质粒构建

2.2.2 多年生黑麦草遗传转化

2.2.3 转化子鉴定

3.结果

3.1 载体构建策略

3.2 质粒p2325和p2326的构建及鉴定

3.3 质粒p2327、p2328的构建和鉴定

3.4 转基因植株的获得

3.5 多福转基因植株鉴定

3.5.1 PCR检测

3.5.2 Southern-bloting分析

3.6 转基因多福植株耐盐、抗旱生理测试

3.6.1 耐盐生理测试

3.6.2 干旱胁迫生理测试

4.讨论

4.1 携转录因子DREB1B／TACBF1载体构建

4.2 转外源目的基因植株的获得

4.3 逆境诱导转录因子DREB1在转基因植物中的作用

4.4 逆境胁迫诱导型基因的启动子

小结

参考文献

文献综述植物生物技术在黑麦草遗传改良中的应用

1.概述

1.1 生物技术在农业生产中的应用

1.2 植物转基因技术

1.2.1 间接遗传转化方法

1.2.2 直接遗传转化方法

1.3 黑麦草的生物学概况

2.生物技术在黑麦草研究中的应用

2.1 组织培养

2.1.1 分生组织培养

2.1.2 愈伤组织培养和体细胞变异

2.1.3 花药培养和单倍体的获得

2.1.4 原生质体培养及植株再生

2.1.5 细胞融合和体细胞杂种

2.2 基因工程

2.2.1 原生质体转化法

2.2.2 碳化硅纤维介导转化法

2.2.3 微粒轰击法

2.2.4 农杆菌介导转化方法

2.3 分子标记和数量性状基因定位

2.3.1 分子标记

2.3.2 数量性状基因的定位

2.3.3 分子标记辅助育种

3.黑麦草转基因研究的主要目标

3.1 品质改良

3.2 提高病害抗性

3.3 控制花粉致敏性

3.4 抗除草剂品种的培育

3.5 提高抗逆性

3.6 生物反应器

4.RNA干扰技术及其在黑麦草遗传改良中的应用前景

5.基因功能和功能基因组的研究

6.转基因黑麦草的安全性

7.黑麦草遗传改良的意义

参考文献

致谢

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