MSTN基因克隆、表达及其主动免疫研究

论文摘要

肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种抑制骨骼肌生长和发育的负向调控因子,其在肌细胞的生成过程中有着重要的功能。MSTN基因的突变或者人为的添加MSTN的抗体都能够提高动物的体增重,促进肌肉的发育（Mcpherron et al. 1997）;口服表达抗原的酵母可以刺激机体产生特异性的抗体（Stubbs A C 2001）。本研究通过在酵母中表达MSTN基因,口服免疫小鼠,促进了小鼠的生长;并构建了MSTN整合的酵母菌株。A.应用外显子拼接技术从猪基因组DNA中扩增出全长猪MSTN基因并构建了原核表达载体pET32a-MSTN。在大肠杆菌BL（DE3）中优化MSTN诱导表达条件并诱导表达带His标签的MSTN融合蛋白,通过镍层析柱纯化MSTN融合蛋白。B.应用外显子拼接技术从鸡基因组DNA中扩增出全长鸡卵清蛋白（ovalbumin, OVA）基因并构建包含多克隆位点的酵母表达载体JMB88-OVA。从载体pET32a-MSTN酶切出MSTN基因插入用相同的内切酶消化过的JMB88和JMB88-OVA,构建酵母表达载体JMB88-MSTN和JMB88-OVA-MSTN。将构建好的两个酵母表达载体导入酵母JMY1中,硫酸铜诱导表达MSTN和OVA-MSTN。应用原核表达的MSTN蛋白和表达MSTN的酵母作为抗原,通过注射原核表达的MSTN蛋白和表达MSTN的酵母以及口服表达MSTN的酵母免疫生长期的小鼠;免疫7周后检测各组小鼠血清有无针对MSTN的抗体并分析小鼠的体增重和各主要骨骼肌重量,验证了口服免疫表达MSTN的酵母可以诱导小鼠产生针对MSTN的特异性的抗体,并促进小鼠生长和骨骼肌的发育。C.在验证了口服表达MSTN的酵母有促进小鼠生长的功能后,设计并构建了MSTN的酵母整合载体pBlue-kan-NTS5’3’-MSTN。将线性化的pBlue-kan-NTS5’3’-MSTN载体导入酵母JMY1,获得MSTN整合酵母菌株JMY11;利用Cre/Loxp系统将报告基因KanMX4删除,得到无抗性基因的MSTN基因整合的酵母菌株JMY12;通过western blot验证了JMY12菌株可以持续表达MSTN蛋白。本研究证明了口服表达MSTN的酵母可以诱导机体产生抗MSTN的抗体,并能够促进动物的生长;同时构建了安全的可直接用作饲料添加剂的表达MSTN的酵母菌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 MSTN 基因研究概述
• 1.1.1 MSTN 基因的发现
• 1.1.2 MSTN 基因的结构
• 1.1.3 MSTN 的生理功能
• 1.1.4 MSTN 的功能调节
• 1.1.5 MSTN 基因在畜牧业中的应用与前景
• 1.2 免疫调控技术在畜牧业的应用
• 1.2.1 主动免疫技术在畜禽生产中的应用
• 1.2.2 被动免疫技术在畜禽生产中的应用
• 1.3 酿酒酵母表达系统
• 1.3.1 酿酒酵母表达载体
• 1.3.2 酵母表达系统中的启动子和终止子
• 1.3.3 酿酒酵母表达系统的优点
• 1.4 重组酵母疫苗概况和原理
• 1.4.1 酵母疫苗的抗原表达和递呈作用
• 1.4.2 强效的免疫激活作用
• 第二章 猪MSTN 基因的克隆及其原核表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 引物设计与合成
• 2.1.2 PCR 扩增猪MSTN 基因
• 2.1.3 构建MSTN 原核表达载体pET32a-MSTN
• 2.1.4 MSTN 基因的表达与纯化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 猪基因组DNA 的提取及猪MSTN 基因的扩增
• 2.2.2 构建载体pET32a-MSTN
• 2.2.3 原核表达MSTN 融合蛋白
• 2.2.4 纯化MSTN 融合蛋白
• 2.3 小结
• 第三章 酵母表达MSTN 及饲养试验
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 构建酵母表达在JMB88-MSTN 和JMB88-OVA-MSTN
• 3.1.2 酵母表达MSTN 和OVA-MSTN
• 3.1.3 饲养试验
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 构建载体JMB88-MSTN 和JMB88-OVA-MSTN
• 3.2.2 酵母表达MSTN 和OVA-MSTN
• 3.2.3 western blot 检测各组小鼠血清MSTN 抗体
• 3.2.4 不同处理多小鼠体增重和骨骼肌的影响
• 3.3 小结
• 第四章 构建整合MSTN 基因的酵母菌株
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 含Loxp 序列的KanMX4 cassette 的扩增并构建载体pBlue-KanMX4
• 4.1.2 两端同源臂的连接
• 4.1.3 构建MSTN 整合载体pBlue-kan-NTS5’3’-MSTN
• 4.1.4 MSTN 整合于酵母JMY1
• 4.1.5 敲除报告基因 KanMX4 和 MSTN 表达的检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 构建酵母基本整合载体pBlue-kan-NTS5’3
• 4.2.2 构建MSTN 整合载体pBlue-kan-NTS5’3’-MSTN
• 4.2.3 MSTN 整合于酵母JMY1
• 4.3 小结
• 第五章 结论
• 5.1 研究结论
• 5.2 研究创新点
• 5.3 还需深入的研究
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介