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毕赤酵母高效表达融合蛋白的环境和控制条件研究

2020-12-02阅读(488)

毕赤酵母高效表达融合蛋白的环境和控制条件研究

论文摘要

本论文以DO-Stat法和人工神经网络动态模式识别控制法（Artificial Neural Network Pattern Recognition based control,ANNPR-Ctrl）为手段,对毕赤酵母流加培养生产融合蛋白HSA-IL-2过程中的甘油流加控制策略和性能指标进行了比较研究。在细胞生长期采用基于DO（溶解氧）/pH在线测量的ANNPR-Ctrl法特别有效。它可以有效地增加细胞的生产强度,缩短培养时间,使以甲醇为诱导剂的融合蛋白的诱导开始时间大幅提前。但是,在诱导期,甲醇浓度必须控制在一定水平才能实现融合蛋白的有效表达。同时,重组毕赤酵母菌（KM71,MutS）利用甲醇能力弱,无法利用DO和pH判断甲醇的过量或匮乏的状况。因此,在诱导期使用甲醇在线电极来控制甲醇流加,可以将甲醇浓度控制在设定范围之内,实现融合蛋白的有效表达。利用重组毕赤酵母菌（KM71,MutS）表达生产人白蛋白修饰的白介素- 2（HSA-IL-2）过程中,DO和甲醇浓度是影响目标蛋白表达的关键因素。实验发现HSA-IL-2生产菌对DO的需求不是很高,通过使用空气并结合调节搅拌转速就能满足其对DO的需求。诱导3天后,在正常DO、较低甲醇浓度下（DO 20-60%,甲醇浓度5-8g/L）,HSA-IL-2表达量为23mg/L,为摇瓶表达量的2.5倍;在高DO、低甲醇浓度（DO 80%-120%,甲醇浓度2-5g/L）下,HSA-IL-2表达量可进一步提高18%,达到27mg/L;DO振荡、低甲醇浓度（甲醇浓度2-7g/L）条件不利于HSA-IL-2的表达;在正常DO、较高甲醇浓度下（DO 20-60%,甲醇浓度15-23g/L）,HSA-IL-2表达量最高,达到44.6mg/L。诱导前期,甲醇浓度过高易导致菌体中毒,不利于HSA-IL-2的表达。此外,在诱导阶段,通过限制性添加甘油可以有效提高菌体的呼吸活性,促进菌体生长,并且缓解甲醇对菌体的毒性。本文还对重组毕赤酵母菌（GS115,Mut+）表达融合蛋白HSA-CP进行了初步研究。实验发现该菌对DO的需求很高。通富氧空气（50%,V/V）时最高菌体浓度OD600可达到600,约为通空气时相应值的1.8倍。与HSA-IL-2生产菌相比,该菌的诱导特性也不同。它利用甲醇能力强、诱导时间短,在5L发酵罐诱导15h内,HSA-CP蛋白表达量就可以达到最大值,而相应的摇瓶水平的最大蛋白表达量要在诱导3天才能达到。使用空气时HSA-CP最高表达量为108mg/L,略低于摇瓶;而通富氧空气时HSA-CP最高表达量可提高一倍,达到237mg/L。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 巴斯德毕赤酵母（PICHIA PASTORIS）表达系统
  • 1.1.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性
  • 1.1.2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优点
  • 1.1.3 巴斯德毕赤酵母在外源蛋白生产中的广泛应用
  • 1.2 融合药物蛋白简介
  • 1.2.1 白介素-2 简介
  • 1.2.2 C 肽简介
  • 1.3 高密度培养的国内外研究进展
  • 1.3.1 高密度培养简介
  • 1.3.2 高密度培养的补料方式
  • 1.3.3 高密度培养的国内外研究进展
  • 1.4 微生物发酵过程的研究现状和发展趋势
  • 1.4.1 发酵过程控制概论
  • 1.4.2 发酵控制现状和发展趋势
  • 1.5 立题意义
  • 1.6 本论文的主要研究内容
  • 第二章 5L 发酵罐条件下重组毕赤酵母表达HSA-IL-2 的基础研究
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 材料
  • 2.2.2 仪器与设备
  • 2.2.3 微生物菌种
  • 2.2.4 培养基
  • 2.2.5 前培养方法
  • 2.2.6 分析方法
  • 2.2.7 流加控制方法
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 重组毕赤酵母生长、诱导阶段DO 变化模式研究
  • 2.3.2 使用DO-Stat 法和ANNPR-Ctrl 法时，增殖期毕赤酵母生长状况的比较
  • 2.3.3 诱导前期，菌体对不同甲醇控制浓度水平的适应研究
  • 2.4 本章小结
  • 第三章 不同环境和控制条件下毕赤酵母表达HSA-IL-2 的研究
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 材料、仪器与设备、微生物菌种、培养基、前培养方法、分析方法、流加控制方法
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 不同环境条件下，毕赤酵母生长状况的比较
  • 3.3.2 诱导阶段，不同DO 控制条件对毕赤酵母表达HSA-IL-2 的影响
  • 3.3.3 诱导阶段，不同甲醇浓度对毕赤酵母表达HSA-IL-2 的影响
  • 3.3.4 不同环境控制条件下各指标比较
  • 3.3.5 诱导阶段，不同的甲醇过量条件对毕赤酵母表达HSA-IL-2 的影响
  • 3.3.6 诱导阶段，限制性添加甘油对菌体生长及呼吸活性的影响
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 5L 发酵罐条件下重组毕赤酵母表达HSA-CP 的研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 材料
  • 4.2.2 仪器与设备
  • 4.2.3 微生物菌种
  • 4.2.4 培养基
  • 4.2.5 前培养方法
  • 4.2.6 分析方法
  • 4.2.7 流加控制方法
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 生长阶段重组毕赤酵母的发酵特性
  • 4.3.2 不同DO 环境下重组毕赤酵母的表达HSA-CP 的比较研究
  • 4.4 本章小结
  • 第五章 结论与展望
  • 5.1 两种菌的发酵特性的比较
  • 5.2 主要结论
  • 5.3 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 相关论文文献

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