论文题目: 人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 马杰
导师: 颜炜群
关键词: 重组人热休克蛋白,多肽疫苗,毕赤酵母,大规模发酵纯化工艺
文献来源: 吉林大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究利用基因重组技术构建了人HSP70 真核表达载体pPICZα/hhsp70,电转化毕赤酵母X-33 后,筛选出稳定高效的分泌表达rhHSP70 的工程菌株。经SDS-PAGE,Western blot,亲和层析和离子交换层析纯化及N-端氨基酸测序分析证明rhHSP70 与天然hHSP70 具有相同的序列和理化性质。同时利用固相多肽合成法合成了人HER2/neu蛋白的CTL表位P106-114和P369-377,并在体外与rhHSP70形成复合物,用rhHSP70-多肽复合物和GM-CSF+多肽分别免疫小鼠,进行诱导HER2/neu蛋白特异性CTL的实验研究。结果表明:rhHSP70-多肽复合物比GM-CSF+多肽更有效地促进T淋巴细胞分泌IFN-γ,诱导特异性CTL杀伤表达人HER2/neu蛋白的小鼠乳腺癌细胞,并使肿瘤组织出现大范围的坏死和凋亡,对乳腺癌模型小鼠的治疗作用也明显优于GM-CSF+多肽。说明rhHSP70 具有与天然hHSP70 相同的免疫活性。进而在80L发酵条件下,进行了rhHSP70 表达条件的优化,并建立一种适合于大规模纯化rhHSP70 的新方法。本实验的创新之处在于:1)首次在毕赤酵母中高效表达了rhHSP70 ;2)首次证实将HER2/neu蛋白的CTL表位P106-114和P369-377与hHSP70 结合形成复合物,可诱发机体强大的特异性免疫反应,用于乳腺癌的免疫治疗;3)建立了大规模发酵和纯化rhHSP的新方法。
论文目录:
前言
第一章 文献回顾
第一节 热休克蛋白70
第二节 肿瘤免疫和肿瘤免疫进展
第二章 rhHSP70 毕赤酵母高效分泌表达体系的建立和鉴定
第一节 材料和方法
第二节 结果
第三节 讨论
第三章 rhHSP70 的生物学活性测定
第一节 抗原肽的合成、纯化与鉴定
第二节 合成抗原肽与rhHSP70的非共价结合
第三节 rhHSP70-抗原肽复合物诱导特异性细胞毒性T 细胞
第四节 rhHSP70-抗原肽复合物的抑瘤实验研究
第五节 实验结果
第六节 讨论
第四章 rhHSP70大规模发酵及纯化
第一节 材料和方法
第二节 结果
第三节 讨论
研究总结
参考文献
附录一 pPICZα/hHSP70 序列分析结果
附录二 rhHSP70 N 端序列分析结果
附录三 rhHSP70 阳离子纯化图
附录四 合成多肽质谱分析图
附录五 合成多肽纯化图谱
附录六 光镜照片
附录七 电镜照片
攻读博士期间发表的学术论文及其他成果
中文摘要
英文摘要
致 谢
发布时间: 2005-08-26
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标签：重组人热休克蛋白论文; 多肽疫苗论文; 毕赤酵母论文; 大规模发酵纯化工艺论文;