山羊卵母细胞体外成熟及核移植研究

论文摘要

研究了在培养液中添加不同浓度的EGF﹑IGF-1 以及EGF 联合IGF-1 对山羊有腔卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:1)10μg/L﹑20μg/L﹑30μg/LEGF 对山羊卵母细胞体外成熟无显著影响（P>0.05） 。（2） 10μg/L的IGF-1 对山羊卵母细胞体外成熟无显著影响（P>0.05）;0μg/L﹑30μg/L的IGF-1 能显著提高山羊卵母细胞体外成熟率（P<0.05） 。（3） 添加10μg/LEGF+20μg/LIGF-1 组卵母细胞体外成熟率显著高于添加20μg/L 的IGF-1 组（P<0.05）,极显著高于添加10μg/LEGF 组和对照组（P<0.01） 。结论:EGF 和IGF-1 对有山羊卵母细胞体外成熟有协同作用。体外成熟的卵母细胞用CB 处理30min 或不用CB 处理,经孤雌激活后,在CR1aa（实验Ⅰ）和SOFaa（实验Ⅱ）中培养,在培养第3 d 添加10%FBS 或10%EGS 观察发育情况。结果:在实验Ⅰ中,CB 处理组和无CB 处理组间孤雌激活卵卵裂率和囊胚率无显著差异,CB 处理组囊胚率稍高于不用CB 处理组;在CR1aa 中添加10%EGS 的孤雌胚囊胚率显著高于添加10%FBS（p<0.05）。在实验Ⅱ中,CB 处理组和无CB 处理组间孤雌激活卵卵裂率和囊胚率无差异;在SOFaa 中添加10%EGS 的孤雌胚囊胚率显著高于添加10%FBS（p<0.05）。结果表明:CB 对山羊孤雌激活胚胎体外培养无显著影响。在培养液中添加EGS的效果显著高于添加FBS。SOFaa 对山羊孤雌激活胚的培养效果优于CR1aa。以山羊胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和人胎儿成纤维细胞为供体进行核移植研究。对比了胞质内注射和电融合对重组胚早期发育的影响。结果:应用胞质内注射法时,颗粒细胞和山羊胎儿成纤维细胞支持重组胚的发育能力极显著高于人胎儿成纤维细胞;颗粒细胞显著高于山羊成纤维细胞。山羊成纤维细胞电融合成功率显著高于人胎儿成纤维细胞。结论:人胎儿成纤维细胞能在山羊去核卵母细胞内重组发育,但发育能力极显著低于山羊胎儿成纤维细胞和颗粒细胞。

论文目录

• 文献综述
• 第一章 异种动物细胞核移植研究进展
• 1.1 概念
• 1.1.1 克隆
• 1.1.2 核移植
• 1.2 哺乳动物核移植研究进展
• 1.2.1 同种核移植
• 1.2.2 异种核移植
• 1.3 核移植的技术程序
• 1.3.1 受体卵母细胞的去核
• 1.3.2 供体细胞与受体胞质的融合
• 1.3.3 重组卵的激活
• 1.3.4 重组胚的培养
• 1.3.5 重组胚的移植
• 1.4 影响克隆成功率的因素
• 1.4.1 卵母细胞来源
• 1.4.2 卵母细胞及供体细胞的胞质容量
• 1.4.3 卵母细胞去核方案
• 1.4.4 供体细胞的来源
• 1.4.4.4 供体细胞的冷冻与冷藏对核移植效果的影响
• 1.4.5 融合一激活方案
• 1.4.6 核移植方案
• 1.4.7 重组胚培养
• 1.5 哺乳动物克隆技术中几个理论问题
• 1.5.1 端粒与端粒酶
• 1.5.2 重组胚基因嵌合
• 1.5.3 供体核的重编程
• 1.6 异种动物细胞核移植的意义和应用前景
• 1.6.1 拯救濒危动物是异种动物细胞核移植技术应用最有潜力的领域
• 1.6.2 用于人类胚胎干细胞建系的研究是异种动物细胞核移植最诱人的课题
• 1.6.3 生产转基因动物
• 1.6.4 促进基础学科的发展
• 1.6.5 在畜牧业生产中的应用
• 1.7 异种动物核移植存在的问题
• 1.7.1 总体效率太低
• 1.7.2 妊娠流产率高,受体产子率低
• 1.7.3 出生动物死亡率高
• 1.7.4 核移植程序需要改进,尚需探索新的核移植程序
• 1.7.5 重构胚的构建有待进一步的研究和探索
• 实验研究
• 第二章EGF 和IGF-I 对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 卵巢的采集
• 2.1.2 卵母细胞的采集
• 2.1.3 成熟培养
• 2.1.4 卵母细胞的成熟鉴定
• 2.1.5 统计方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 EGF 对卵母细胞体外成熟的影响
• 2.2.2 IGF-I 对卵母细胞体外成熟的影响
• 2.2.3 EGF 联合IGF-I 对山羊卵母细胞体外成熟的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 不同类型血清及培养液和CB处理对山羊孤雌胚胎体外培养的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 试剂与用品
• 3.1.2 卵丘卵母细胞复合体（COCs）的回收和体外成熟
• 3.1.3 成熟卵母细胞的激活
• 3.1.4 胚胎培养所用基础培养液
• 3.1.5 孤雌胚胎的体外培养
• 3.1.6 数据处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 CR1aa 培养液中不同类型的血清对山羊孤雌激活胚体外发育的影响
• 3.2.2 SOFaa 培养液中不同类型的血清对山羊孤雌激活胚体外发育的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 细胞松弛素B 对山羊孤雌激活胚体外发育的影响
• 3.3.2 不同类型的血清对山羊孤雌激活胚体外发育的影响
• 3.4 小结
• 第四章 山羊核移植研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 卵丘卵母细胞复合体（COCs）的回收
• 4.1.2 卵母细胞的体外成熟和去核
• 4.1.3 供体细胞的准备
• 4.1.4 核移植胚的构建
• 4.1.5 重组胚的激活
• 4.1.6 核移植胚胎的体外培养
• 4.1.7 胚胎培养所用基础培养液
• 4.1.8 试验数据的统计分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 颗粒细胞和山羊胎儿成纤维细胞在去核卵母细胞内的发育
• 4.2.2 山羊胎儿成纤维细胞和人胎儿成纤维细胞在去核卵母细胞内的发育
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 附件
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历