论文摘要
深海热液口及其生物群落自1977年发现以来,就受到海洋学界和生物界的广泛关注。生活在热液口的微生物作为地球生物系统的重要组成部分,由于其在生态、资源、环境等方面的重要性,以及在新药物开发等工业方面巨大的潜在应用价值,越来越受到人们的重视。近年来研究发现,病毒在控制热液口生物群落存在与否方面起重要作用,对热液口古菌病毒已有一些报道,但是有关热液口细菌病毒（即噬菌体）却鲜见报道。对热液口嗜热菌噬菌体的研究,不仅有助于了解噬菌体在控制热液口生物群落中所起的作用,而且对探索生命起源也具有重要的意义。因此,本论文的主要工作是,在前期研究基础上,探索嗜热菌与其噬菌体之间的关系。为了探索噬菌体与宿主相互作用的分子机理,本文以本实验室分离获得的深海热液区嗜热菌噬菌体GVE2为材料,首先从转录和表达水平找出与噬菌体感染相关的差异基因和蛋白。在转录水平上,运用随机引物PCR技术（Random arbitrarily primedPCR,RAP-PCR）,在筛选到的14个差异片段中,我们选取了5个差异片段进一步用Northern blot进行验证,其中有3个差异基因证实在转录水平上存在着表达差异。利用噬菌体感染和未感染嗜热菌,进行SDS-PAGE及双向电泳分析,对差异蛋白条带和点进行质谱鉴定,通过蛋白质组学分析,共有17种差异蛋白被发现。对差异表达蛋白相应的基因进行标记,采用Northem blot检测基因转录量,有17个差异蛋白被证实与蛋白电泳图谱结果一致。在总计20个差异基因中,其中有13个表现为上调表达,7个表现为下调表达,这些基因主要涉及宿主的能量代谢和转录调控等方面。从20个基因中选择天冬氨酸转氨酶（AST）进行基因功能研究,利用基因插入失活手段将编码耐高温卡那霉素的基因插入AST基因中间,构建AST突变株。Real-time分析结果表明,AST与噬菌体的感染有关。为了了解这些蛋白通过何种途径参与噬菌体感染,本文选用AST进一步进行蛋白质互作研究。采用免疫共沉淀技术,从Geobacillus sp.E263中获得与其结合的蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白,利用细菌双杂交系统验证,结果显示,AST和分子伴侣蛋白存在相互作用。本论文还对GVE2的单链DNA结合蛋白（SSB）进行了研究,SSB是所有生物生存不可缺少的一种蛋白,由于其在分子生物学以及分析技术中的多种用途,引起了越来越多的关注。在本试验中,一个新的SSB蛋白首次被从深海嗜热噬菌体GVE2中鉴定,该SSB蛋白与其它种类的SSB蛋白具有很大的相似性。以噬菌体GVE2基因组为模版,克隆了SSB基因,并在E.coli,中进行SSB蛋白的表达和纯化,制备了抗体。Northern blot和Western blot分析结果显示,该SSB蛋白的基因是噬菌体GVE2体内的一个早期基因。通过与单链DNA的结合试验表明,经过重组的SSB蛋白具有结合单链DNA的能力。此外,本研究还利用深海热液区样品,分离嗜热菌及产电细菌。首次从大西洋深海热液口筛选到一株依靠发酵可以产电的细菌,根据16S rDNA序列分析的结果,该株产电细菌被命名为Shewanella sp.DS1,其生长最适温度和最适PH值分别为30℃和6.5。研究结果表明,该株产电细菌的产电能力随着培养时间而增加,在15小时左右得到最大值为0.29mA,以后随着时间的流逝而降低。