论文摘要
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,常规的治疗手段尚不能取得理想的效果,肿瘤基因治疗作为一项新兴的研究领域,为人类攻克这疾病带来了新的希望和契机。诱导肿瘤细胞凋亡而杀灭肿瘤的思路,将会产生一些高效、低毒的肿瘤基因治疗方案。凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）是近年来发现的一种线粒体相关的凋亡效应分子,其在线粒体外空间的分布,尤其是在细胞核内的积聚,将足以引起细胞核染色体凝集和断裂,导致细胞凋亡的发生,不受Bcl-2过表达的影响,抑制caspase的活性仍不能阻止其诱导的凋亡发生,而且AIF在低等真核细胞凋亡以及哺乳类胚胎发育过程中具有不可或缺的作用。与caspase等其他凋亡效应分子相比,AIF具有不受胞浆中其他凋亡抑制因子抑制,可直接诱导细胞凋亡发生的优势。将其用于诱导肿瘤细胞凋亡,可能具有重要意义。本文利用PCR方法构建了AIF截短体AIFΔ1-120、AIFΔ1-480和ΔAIF360-480,为检测方便,在截短体分子的C-末端融合了8个氨基酸残基组成的FLAG标签,经过酶切鉴定以及DNA测序证明,各载体构建成功;瞬时转染HeLa细胞,Western Blot证实截短型AIFΔ1-120、AIFΔ1-480ΔAIF360-480均在转染细胞中获得过表达,利用激光共聚焦显微镜观察异源性表达的AIF截短体分子细胞内定位情况,发现去掉线粒体定位序列（MLS）但保留核定位序列（NLS）的AIFΔ1-120表达后分布在胞质和胞核中,而同时失去MLS和NLS的AIF截短体（AIFΔ1-480和ΔAIF360-480）仅仅分布在细胞质中;瞬时转染HeLa细胞,经过Annexin V、TUNEL染色、MTT、集落形成试验等方法证实AIFΔ1-480能够和AIFΔ1-120一样引起细胞发生凋亡。AIF的C末端截短体分子可以引起细胞色素c从线粒体释放至胞浆,而细胞色素c结合Apaf-1可以募集caspase-9形成凋亡体,基于这种机制,构建了caspase-9特异性的siRNA真核表达载体,经DNA序列测定载体构建正确,转染HeLa细胞并用G418筛选建立稳定转染细胞株,用RT-PCR方法检测caspase-9 mRNA水平的变化,Western Blot以及间接免疫荧光检测caspase-9蛋白水平的改变,证实成功抑制了caspase-9的表达,将各AIF截短体瞬时转染caspase-9表达被siRNA抑制的HeLa细胞,经过MTT法测定细胞生长曲线,结果表明caspase-9表达沉寂后AIFΔ1-480的促凋亡活性受到抑制而AIFΔ1-120的促凋亡活性没有受到明显影响。在immunoAIFΔ1-120的基础上构建了新的免疫促凋亡分子,包含有识别HER-2抗原的单链抗体scFv23、绿脓杆菌外毒素转膜结构域PE40和AIFC末端的融合分子,该融合蛋白呈现分泌表达,特异性识别杀伤HER-2阳性肿瘤细胞,而对不表达HER-2抗原的细胞不具有杀伤作用。与immunoΔAIF120分子相比,新构建的免疫促凋亡分子分子量更小,杀伤效率可能更高,因而可能更具有应用价值。