论文摘要
马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp．zooepidemicus）对集约化养猪业的发展危害严重，同时对养猪业的相关从业人员的健康具有潜在威胁。能引起猪和人的脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎、及突发性死亡，是重要的人兽共患病病原。纤连蛋白（fibronectin，Fn）是由α和β链组成的一种二聚体糖蛋白，由多种类型的细胞表达产生，Fn在动物体内以可溶形式存在于血浆及各种体液中，以不溶形式存在于细胞外基质及细胞表面。前者总称血浆Fn，后者总称细胞Fn。纤连蛋白结合蛋白（fibronectin-binding protein，FNZ）是链球菌一种重要的表面蛋白和毒力因子，是链球菌建立感染所依附的重要的表面分子之一，该菌是重要的黏附素。本试验在分子水平上对马链球菌兽疫亚种FNZ蛋白的功能片段进行了研究，为该菌的致病机制和基因工程疫苗的研制进行了有益的探索。根据已经发表的马链球菌兽疫亚种纤连蛋白结合蛋白的基因序列，设计和合成一对引物，并以ATCC35246株的基因组为模板，通过PCR技术，扩增出缺失信号肽的FNZ基因，并定向克隆至PMD19-T载体中。酶切鉴定正确后，对克隆片段进行序列测定，其长度为1895bp。利用DNAstar软件，比较所测序列与不同来源链球菌的纤连蛋白序列的同源性，该序列与已经发表的马链球菌兽疫亚种VTU211菌株FNZ基因的同源性为89．9％，氨基酸同源性为84．4％，其中突变部位较多，而且中间有111个碱基缺失。与马链球菌马亚种的同源性为78％，氨基酸同源性为44．1％，与其他链球菌的同源性较低。根据ATCC35246的FNZ基因序列，设计和合成五对引物，用PCR方法分别扩增出FNZ基因的4-277bp、4-808bp、592-1134bp、895-1615bp区间和全长的基因片段。将扩增片段双酶切后用T4 DNA连接酶定向克隆于融合表达载体pET-32a（+）的相应酶切位点。构建pFNZ（2-91）、pFNZ（2-268）、pFNZ（197-378）、pFNZ（299-538）和pFNZ重组质粒，对阳性插入片段进行酶切测序鉴定，结果表明pFNZ（2-91）、pFNZ（2-268）、pFNZ（197-378）、pFNZ（299-538）和pFNZ的插入序列与ATCC35246FNZ的相应序列完全一致。将重组质粒转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，表达产物大小分别为31、50、40、45、84kD，与预测结果一致。采用配基印迹结合试验确定FNZ上Fn的结合部位，结果表明pFNZ（2-268）、pFNZ（197-378）、pFNZ（299-538）和pFNZ与人的Fn结合。据此推断在FNZ基因的277-808bp、895-1134bp，即197-268aa、299-378aa之间有Fn的线性结合位点。将含有Fn线性结合部位的重组质粒细菌进行表达，SDS-PAGE检测，结果表明表达的蛋白位于上清之中，以His亲和层析柱纯化表达蛋白，将纯化好的蛋白与ISA206佐剂1：1进行乳化后免疫ICR小鼠，融合蛋白免疫方式为pFNZ（2-268）、pFNZ（299-538）和pFNZ（2-268）+pFNZ（299-538），以0．2ml（1．0×108cell／ml）ATCC35246强毒株攻击后，小鼠的存活率分别为20％、30％和30％，证实所表达的蛋白具有一定的保护性，为马链球菌兽疫亚种重要的保护性抗原。
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