白菜花粉发育相关基因BcMF3和BcMF4的转基因功能验证

论文摘要

芸薹属（Brassica）植物是杂种优势利用最为普遍的作物种类之一,其雄性不育的机理及雄性不育系选育的研究一直深受重视。但是,雄性不育产生的机制仍然是一个尚未完全解开之谜,还有许多问题需要深入研究。在国家自然科学基金委和浙江省科技厅的资助下,本实验室在前一阶段利用mRNA DD-PCR、cDNA-AFLP技术结合RACE技术,从普通白菜（B.campestris ssp.chinensis（L.）Makino var.communis Tsen et Lee）核雄性不育两用系中成功分离得到了与白菜核雄性不育相关基因CYP86MF、BcMF1、BcMF2、BcMF3和BcMF4。对其中的BcMF3和BcMF4基因的RT-PCR分析表明,它们都只在普通白菜两用系可育株系的中蕾和大蕾中特异表达。为进一步了解BcMF3和BcMF4基因的生物学功能,将普通白菜花蕾按大小进行更细分级,首先采用Northern杂交分析对BcMF3和BcMF4在白菜中的表达特征进行了进一步的确认:接着构建了这两个基因的组成型启动子CaMV 35S的和绒毡层组织特异性启动子A9的反义RNA和RNA干涉基因沉默植物表达载体:然后将所构建的载体,采用Floral Dip法转化拟南芥（Arabidopsis thaliana）,通过组织培养途径转化与普通白菜同属于白菜亚种的菜心（B.campestris ssp.chinensis （L.）Makino var.parachinensis（Bailey）Tsen et Lee）,获得了拟南芥3个载体的共12株转基因植株、菜心10个载体的共148个转基因植株株系:随后对转基因拟南芥和菜心植株的花粉形态、花粉萌发率与活力、花粉管的伸长、果胶甲酯酶的酶活性及不同载体的转化效率进行了观察和检测,取得结果如下: （1）采用Northern blot分析了BcMF3和BeMF4基因的表达特征。结果显示,BcMF3基因只在普通白菜核雄性不育两用系（‘ZUajh97-01’）可育株的直径为1.1mm以上的花蕾中特异表达,并且在1.2～2.5mm的花蕾中强表达,而在可育株<1.2mm的花蕾、可育株的叶片和不育株的混合花蕾中均不表达;BcMF4基因在可育株1.2～2.5mm的花蕾中特异表达,而在可育株<1.2mm和>2.5mm的花蕾、可育株的叶片和不育株的混合花蕾中均不表达。表明BcMF3和BcMF4基因可能与白菜的花粉发育有关,而且主要作用在花粉成熟前后。 （2）构建了BcMF3和BcMF4基因的组成型启动子CaMV 35S的和绒毡层组织特异性启动子A9的反义RNA和RNA干涉基因沉默植物表达载体共10个,并分别将它们导入了农杆菌LBA4404菌株中。 （3）将所构建的10个载体的农杆菌菌液采用Floral Dip法转化拟南芥。通过卡那霉素筛选,得到了3个具有CaMV 35S启动子的载体pBI-B3、pBI-B4R和pBI-BB34的共12株抗性转基因植株,PCR和Suothern blot分析证明外源基因成功整合到了这些转基因植株的基因组中,同时说明

论文目录

• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 植物果胶甲酯酶的研究
• 1.1.1 植物果胶甲酯酶的结构模型
• 1.1.2 植物果胶甲酯酶的作用方式
• 1.1.3 花粉特异果胶甲酯酶基因的分离
• 1.2 植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的研究
• 1.2.1 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的结构与分布
• 1.2.2 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因
• 1.2.3 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白与花粉发育
• 1.3 RNA干涉研究进展
• 1.3.1 RNA干涉现象的发现及其特点
• 1.3.2 RNA干涉的作用机理
• 1.3.2.1 小片段dsRNA与基因沉默
• 1.3.2.2 RNA干涉所需的基因
• 1.3.2.3 RNA干涉的可能机制
• 1.3.3 RNA干涉技术
• 1.3.3.1 编码区RNA干涉技术
• 1.3.3.2 启动子区KNA干涉技术
• 1.3.4 RNA干涉的应用
• 1.3.4.1 功能基因组分析的应用
• 1.3.4.2 生物遗传改良中的应用
• 1.3.4.3 有害基因表达的抑制
• 2 BcMF3和BcMF4基因表达的Northern杂交分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 RNA的分离及检测
• 2.1.3 cDNA的合成
• 2.1.3.1 第一链cDNA的合成
• 2.1.3.2 cDNA的LD-PCR扩增
• 2.1.4 Northern杂交
• 2.1.4.1 RNA印迹
• 2.1.4.2 探针的制备
• 2.1.4.3 杂交反应及洗膜
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 RNA的提取与cDNA的合成
• 2.2.2 BcMF3基因的表达特征
• 2.2.3 BcMF4基因的表达特征
• 2.3 讨论
• 3 BcMF3和BcMF4的基因沉默植物表达载体的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 总体策略
• 3.1.2 菌株、质粒和试剂
• 3.1.3 目的片断的克隆
• 3.1.3.1 质粒DNA的提取
• 3.1.3.2 反义BcMF3基因片段的克隆
• 3.1.3.3 反义BcMF4基因片段的克隆
• 3.1.3.4 正义BcMF3基因片段的克隆
• 3.1.3.5 正义BcMF4基因片段的克隆
• 3.1.4 CaMV35S启动子的BcMF3和BcMF4基因沉默表达载体的构建
• 3.1.4.1 反义RNA表达载体的构建
• 3.1.4.2 双价反义RNA表达载体的构建
• 3.1.4.3 RNA干涉表达载体的构建
• 3.1.5 A9启动子的BcMF3和BcMF4基因沉默表达载体的构建
• 3.1.5.1 A9启动子的克隆
• 3.1.5.2 A9启动子的表达载体的构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 目的片断的获得
• 3.2.2 基因沉默的植物表达载体的获得
• 3.2.2.1 CaMV35S启动子的表达载体的获得
• 3.2.2.2 A9启动子的表达载体的获得
• 3.3 讨论
• 4 BcMF3和BcMF4的基因沉默植物表达载体对拟南芥的转化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料、菌株及抗生素
• 4.1.2 Floral dip法转化植株
• 4.1.2.1 拟南芥的培养
• 4.1.2.2 农杆菌的培养
• 4.1.2.3 Floral dip法转化植株
• 4.1.3 转化苗的抗生素筛选
• 4.1.4 拟南芥基因组DNA的提取
• 4.1.5 拟南芥中BcMF3和BcMF4基因同源片断的PCR扩增
• 4.1.6 抗性转化植株的分子鉴定
• 4.1.6.1 抗性转化植株的PCR检测
• 4.1.6.2 抗性转化植株的Southern杂交检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 野生型拟南芥中BcMF3和BcMF4基因的同源片断
• 4.2.2 抗性转化植株的获得
• 4.2.3 抗性转化植株的PCR分析
• 4.2.4 抗性转化植株的Southern杂交分析
• 4.3 讨论
• 5 BcMF3和BcMF4的基因沉默植物表达载体对菜心的转化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料、菌株及抗生素
• 5.1.2 菜心无菌苗的培养
• 5.1.3 菜心的遗传转化
• 5.1.3.1 预培养
• 5.1.3.2 浸染农杆菌
• 5.1.3.3 共培养
• 5.1.3.4 分化培养
• 5.1.3.5 生根培养
• 5.1.4 菜心基因组DNA的提取
• 5.1.5 菜心中BcMF3和BcMF4基因同源片断的PCR扩增
• 5.1.6 抗性转化植株的分子鉴定
• 5.1.6.1 抗性转化植株的PCR检测
• 5.1.6.2 抗性转化植株的Southern杂交检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 菜心中BcMF3和BcMF4基因的同源片断
• 5.2.2 抗性转化植株的获得
• 5.2.3 抗性转化植株的PCR分析
• 5.2.4 抗性转化植株的Southern杂交分析
• 5.3 讨论
• 6 BcMF3和BcMF4的基因沉默转基因植株的育性相关性状分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 植物材料、仪器及试剂
• 6.1.2 花器官的形态学观察
• 6.1.3 花粉形态的扫描电镜观察
• 6.1.4 花粉的离体萌发
• 6.1.5 花粉活力的检测
• 6.1.6 花粉在雌蕊中的生长观察
• 6.1.7 果胶甲酯酶活性的测定
• 6.1.7.1 样品准备
• 6.1.7.2 酶浓度测定
• 6.1.7.3 酶活性测定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 转基因植株的花器官形态
• 6.2.2 转基因植株的花粉形态
• 6.2.2.1 拟南芥转基因植株的花粉形态
• 6.2.2.2 菜心转基因植株的花粉形态
• 6.2.3 转基因植株花粉的离体萌发
• 6.2.3.1 拟南芥转基因植株的花粉离体萌发
• 6.2.3.2 菜心转基因植株的花粉离体萌发
• 6.2.4 菜心转基因植株的花粉活力
• 6.2.5 转基因植株花粉管在雌蕊中的生长
• 6.2.6 不同载体转化菜心的沉默效率
• 6.2.7 菜心转基因植株果胶甲酯酶的活性
• 6.3 讨论
• 6.3.1 BcMF3和BcMF4基因与雄性不育
• 6.3.2 启动子类型对沉默BcMF3和BcMF4基因的影响
• 6.3.3 载体类型对沉默BcMF3和BcMF4基因的影响
• 6.3.4 果胶甲酯酶与花粉发育
• 6.3.5 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白与花粉发育
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表的论文