肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）基因的改造及其在毕赤氏酵母菌中的表达分析

论文摘要

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL）是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）基因超家族众多成员之一,能通过死亡受体的参与而诱导细胞凋亡。 TRAIL与肿瘤细胞膜表面特殊的复杂的受体系统（两个死亡受体和三个诱骗受体）相互作用。由于它的三聚体形式能诱导许多转化细胞凋亡却不会杀伤正常细胞的特性而有望成为极有潜力的治疗肿瘤的药物,引起研究者极大的兴趣。 本研究利用甲醇毕赤氏酵母表达系统对TRAIL基因进行了表达研究和高效表达菌株的筛选。以pGEM-TRAIL为模板,设计了三对引物P1、P2、P3、P4、P5、P6,利用套叠PCR技术成功地获得了含有KEX2位点和ATTTA位点以及同时含有这两个突变位点的可溶性TRAIL基因片段,并成功地克隆到E.coli DH5α中扩增。 将改造后的TRAIL基因连接到甲醇毕赤酵母Pichia pastoris的YIP型表达载体上,通过Zeocin抗生素筛选,Xba Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切鉴定,获得重组表达载体pPICZα-A-TRAILunmodified、pPICZα-A-TRAILKEX2 mutation、pPICZα-A-TRAILATTTA mutation、pPICZα-A-TRAILKA double mutation。 利用电转化技术将重组表达载体转化毕赤酵母GS115,经Zeocin抗生素筛选、PCR检测获得阳性的酵母工程菌株pPICZα-A-TRAILunmodified/GS115、pPICZα-A-TRAILKEX2 mutation/GS115、pPICZα-A-TRAILATTTA mutation/GS115、pPICZα-A-TRAILKA double mutation/GS115。 摇瓶培养确定毕赤酵母工程菌摇瓶最适pH值为5.5-6.5;最佳甲醇诱导浓度为1%;最适诱导周期为96 h。 利用SDS-PAGE进行高表达菌株的筛选,得到高表达菌株,表达水平分别达到71.5 mg/L（对照）、127.5 mg/L、114 mg/L和183 mg/L,这说明改造后的菌株表达量比未突变的菌株表达量有较明显的提高。 利用CM-柱层析对重组蛋白进行了初步纯化研究。用Western blot检测表明重组蛋白具有TRAIL抗原活性。MTT法检测表达菌株发酵产物显示重组蛋白具有生物活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 基因工程药物研究进展
• 1.1 基因工程制药的概念和特点
• 1.1.1 基因工程制药的概念和方法
• 1.1.2 基因工程制药的特点
• 1.2 基因工程制药的发展
• 1.2.1 基因工程制药的发展历程
• 1.2.2 基因工程制药的发展方向
• 1.3 基因工程制药的发展、现状及面临的问题
• 1.3.1 国外基因工程制药的发展及现状
• 1.3.2 我国基因工程制药产业的发展现状及面临的问题
• 2 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体研究进展
• 2.1 TRAIL的分子结构
• 2.2 TRAIL的受体类型
• 2.2.1 死亡受体
• 2.2.2 诱骗受体
• 2.2.3 OPG
• 2.3 TRAIL作用的分子机制
• 2.3.1 死亡受体介导的凋亡通路
• 2.3.2 NF-κB调控的凋亡通路
• 2.3.3 正常细胞逃逸TRAIL杀伤作用的机制
• 2.4 TRAIL在肿瘤治疗中的特点
• 2.5 TRAIL的研究现状
• 3 外源基因在毕赤酵母表达系统中表达研究进展
• 3.1 P.pastoris的生物学和遗传学特点
• 3.2 表达菌株的构建
• 3.2.1 表达载体
• 3.2.2 可替换的启动子
• 3.2.3 可选择的标记
• 3.2.4 宿主菌
• 3.2.5 表达载体向毕赤酵母基因组的整合
• 3.3 影响外源蛋白表达的因素及提高外源蛋白表达的策略
• 3.3.1 自主复制与表达盒的染色体整合
• 3.3.2 表达盒的整合位点
• +或Mut^S'>3.3.3 宿主的甲基营养表型：MUt⁺或Mut^S
• 3.3.4 基因剂量
• 3.3.5 mRNA5′-和3′-UTR
• 3.3.6 翻译起始密码子AUG前后的序列
• 3.3.7 A+T组成
• 3.3.8 产物稳定性
• 3.3.9 密码子偏爱性
• 3.3.10 KEX2p的影响
• 3.4 影响表达产物活性的因素
• 4 本研究目的与意义
• 5 实验技术路线
• 第二部分 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 分子生物学实验常用酶和试剂（盒）
• 1.3 常用培养基、试剂、缓冲液配方
• 1.3.1 常用培养基配方
• 1.3.2 常用试剂配方
• 1.3.3 常用缓冲液配方
• 1.4 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 TRAIL基因的克隆和鉴定
• 2.1.1 质粒制备和纯化
• 2.1.2 引物设计与基因扩增
• 2.1.3 TRAIL基因的克隆与测序
• 2.2 TRAIL基因表达载体的构建及酵母转化
• α-A）的构建'>2.2.1 表达载体（TRAIL／pPICZ_α-A）的构建
• 2.2.2 酵母转化（电转化法）
• 2.2.3 重组菌株PCR鉴定
• 2.3 重组酵母的SDS-PAGE鉴定
• 2.3.1 摇瓶发酵的一般步骤
• 2.3.2 发酵上清液处理
• 2.3.3 发酵产物的SDS-PAGE电泳
• 2.4 重组酵母摇瓶发酵条件的确定
• 2.4.1 甲醇诱导周期对蛋白表达的影响
• 2.4.2 pH值对蛋白表达的影响
• 2.4.3 甲醇诱导浓度对蛋白表达的影响
• 2.5 高表达菌株的筛选
• 2.6 Westernblot检测
• 2.6.1 SDS-PAGE电泳分离蛋白质
• 2.6.2 转移
• 2.6.3 封闭
• 2.6.4 免疫反应
• 2.6.5 酶显色反应
• 2.7 阳离子交换柱层析
• 2.7.1 树脂的准备和层析柱的填装
• 2.7.2 样品上柱
• 2.7.3 洗柱
• 2.7.4 目的蛋白的洗脱
• 2.8 生物活性检测
• 第三部分 结果与分析
• 1 TRAIL基因的克隆、鉴定和测序
• 1.1 TRAIL基因的PCR扩增
• 1.2 TRAIL基因克隆载体构建及酶切鉴定
• 1.3 TRAIL基因的测序鉴定
• 2 酵母表达载体构建及鉴定
• α-A-TRAIL的构建'>2.1 酵母表达载体pPICZ_α-A-TRAIL的构建
• 3 酵母的转化和重组酵母的PCR鉴定
• 3.1 毕赤酵母转化菌株的PCR鉴定
• 3.2 毕赤酵母转化菌株的甲醇利用表型鉴定
• 4 重组酵母的SDS-PAGE鉴定
• 5 重组酵母摇瓶发酵条件的确定
• 5.1 甲醇诱导周期对蛋白表达的影响
• 5.2 诱导培养基pH值对蛋白表达的影响
• 5.3 甲醇诱导终浓度对蛋白表达的影响
• 6 高表达菌株的筛选
• 7 Western blot分析
• 8 阳离子交换柱层析
• 9 生物活性检测
• 第四部分 讨论
• 1 TRAIL的临床应用前景
• 2 利用套叠PCR对TRAIL基因进行改造
• 3 酵母表达系统的优越性
• 4 表达载体的选择
• 5 转化的影响
• 6 降低外源蛋白降解的方法
• 7 SDS-PAGE过程中的注意事项
• 8 关于MTT比色实验
• 9 本研究今后的主要研究任务
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 缩略语表
• α-A载体图谱'>附录 pPICZ_α-A载体图谱
• 致谢