新疆石榴皮植物雌激素物质基础及石榴品种RAPD分析研究

论文摘要

石榴Punica granatum L.,隶属于石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）。石榴的干燥果皮是其药用部位,具有涩肠、止血、驱虫的功能,用于久泻、久痢、便血、虫积腹痛。据报道,石榴中含有鞣质类、黄酮类及生物碱类成分,尤其是黄酮类成分以具有植物雌激素的活性而成为研究热点之一。植物雌激素作为雌激素的替代品,以其安全性及显著的效果,受到越来越多的关注,从天然药物中筛选具有雌激素作用的药物,并进一步筛选其有效成分是实际可行的。针对新疆石榴品种分类相对混乱现象,对现有石榴品种准确鉴定和合理分类是进一步利用石榴资源的基础。目的:利用人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验与酵母双杂交实验对新疆石榴皮等18种天然药物的植物雌激素作用进行了初步筛选,并对其中具有雌激素活性的新疆石榴皮进行了化学成分的研究。采用分子标记技术和化学分析手段相结合的方法,阐明石榴的分子特征和化学特征,从而为鉴别新疆石榴品种提供实验依据。方法:研究内容分为三个部分:1.采用人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验与酵母双杂交（Yeast two-hybrid）实验对新疆石榴皮、罗勒、红景天、阿里红、鹰嘴豆、枸杞、肉苁蓉、琐阳、鼠尾草、当归、川芎、芍药、桃仁、牡丹皮、桂枝、泽泻、白术、茯苓等18种天然药物进行植物雌激素活性的筛选。2.采用水提取、系统溶剂萃取,分别进行Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、硅胶等柱层析及制备薄层层析,提取新疆石榴皮样品中的化学成分,并运用HPLC法测定鞣质类成分的含量。3.选取不同随机引物对不同产地的23个石榴样本进行RAPD指纹图谱分析。优化RAPD条件后,从中选出多态性高、重复性好的引物对不同样本进行检测,并根据条带的差异进行聚类分析,构建不同石榴品种的RAPD指纹图谱。结果:1.MCF-7细胞增殖实验结果表明:当归、川芎、芍药、白术、牡丹皮、鹰嘴豆、新疆石榴皮、罗勒、泽泻、桂枝水提取物可促使ER（+）MCF-7细胞的增殖（P<0.05）,提示它们具有植物雌激素样活性;酵母双杂交（Yeast two-hybrid）系统实验结果表明:当归、川芎、牡丹皮、鹰嘴豆、石榴皮、泽泻、桂枝、水提取物均能使酵母系统中的β-半乳糖苷酶的活性增强（P<0.05）,提示它们具有植物雌激素样活性。2.从新疆石榴皮中提取分离结果得到13个化合物。根据化合物的理化性质及UV、IR、1H-NMR、13C-NMR等波谱方法,鉴定了10个化合物的结构,分别为:没食子酸（gallic acid）、没食子甲酯（methyl gallate）、鞣花酸（ellagic acid）、（+）-儿茶素[（+）catechin]、异槲皮苷（isoquerecitrin）、D-甘露醇（D-mannitol）、熊果酸（ursolic acid）、齐墩果酸（Oleanolic acid）、β-谷甾醇（β-Sitosterol）、胡萝卜苷（Daucosterol）;并运用HPLC方法测定新疆5个石榴主产地中没食子酸含量为疏附县:3.26mg/g、疏勒县:4.53mg/g、叶城:3.86mg/g、皮山县:2.57mg/g、策勒县:2.94mg/g。结果表明不同产地的化学成分的含量具有明显差异。3.CATBⅠ法提取23份石榴基因组DNA能扩增出清晰的多态性带,确定了适合石榴RAPD反应的反应体系为:10×buffer:2.5μl;dNTP（10mM）:0.5μl;引物（10μM）:5μl;MgCl2（25mmol/l）:0.5μl;Taq DNA聚合酶:0.8μl（2.5μ/μl）;模板DNA（约25ng/μl）:1μl;总体积25μl;剩余的用ddH2O来补充;确定了适合石榴RAPD反应的扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性1min,37℃退火1min,72℃延伸2 min,40循环;72℃总延伸7min后在4℃终止反应。从50个引物中筛选出能稳定扩增的7个引物ZY1、ZY4、ZY12、ZY23、ZY30、ZY41、ZY42,用这些引物对23个石榴品种进行扩增,共扩增出88条带,61条具有多态性,多态性比例为69%。对新疆石榴23个品种进行了RAPD扩增,根据23个品种的Nei相似系数进行聚类分析的结果:能将23个品种聚为5类:第1类包括库尔勒市甜石榴与喀什市大籽甜石榴等甜石榴品种;第2类是阿图什市酸石榴;第3类包括喀什市阿奇克阿娜尔、叶城酸石榴等酸石榴品种;第4类包括吐鲁番市甜石榴、库车酸甜石榴等种间杂交和来源不详品种;第5类包括皮亚曼石榴和策勒1号等新疆优质石榴品种。本研究结果表明:石榴品种间的遗传多态性有明显差异,即使父母本相同的品种,也能分开。结论:1.首次采用人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖实验和酵母双杂交技术,对18种天然药物进行植物雌激素活性的筛选。结果表明新疆石榴皮、罗勒、鹰嘴豆、当归、川芎、芍药、白术、牡丹皮、泽泻、桂枝等7种天然药物的水提物在两种检测方法中均表现出植物雌激素样活性,为今后雌激素类植物资源的开发提供了理论支持。2.首次对新疆石榴皮进行了化学成分研究,从中分离得到13个化合物,鉴定了其中10个化合物的结构,依次为没食子酸、没食子甲酯、鞣花酸、儿茶素、异槲皮苷、齐墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、胡萝卜苷。所有的化合物均为从新疆甜石榴中首次获得。本研究填补了新疆石榴皮化学成分研究的空白。3.首次利用HPLC定量方法对5个新疆主产区的石榴样品的没食子酸含量进行了测定,结果显示:5个产区的石榴样品的没食子酸含量不同,其中疏勒县最高为4.53 mg/g,皮山县最低为2.57 mg/g,这为石榴皮药材全面的质量控制提供了实验依据。4.借助分子生物学平台,首次采用RAPD指纹图谱技术,对新疆不同产地的石榴进行品种研究,结果表明该技术能较好地用于分析种内或种下样品的遗传距离,为解决种下分类鉴定疑点问题提供DNA分子水平的证据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 新疆石榴皮等18 种天然药物植物雌激素活性筛选实验
• 1. 内容与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 酵母双杂交筛检实验
• 1.2.2 人乳腺癌细胞MCF-7 细胞增殖实验
• 2. 实验结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第二部分 新疆石榴皮化学成分的研究
• 1. 内容与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 新疆石榴皮化学成分的提取与分离
• 1.2.2 HPLC 测定新疆不同产地石榴皮中没食子酸的含量
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第三部分 新疆石榴品种资源的RAPD 分析
• 1. 内容与方法
• 1.1 材料、试剂与仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 石榴基因组DNA 的提取
• 1.2.2 RAPD 随机引物选择
• 1.2.3 RAPD 反应体系优化
• 1.2.4 RAPD 扩增程序选择
• 1.2.5 RAPD 条带检测
• 1.2.6 数据分析
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 结论
• 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 在读期间主持的课题
• 个人简历
• 导师评阅表