论文摘要
背景及目的即使是相同种属、相同性别、相同周龄、相同体重及相同营养状况的大鼠,其对特定程度的失血所引起的失血性休克的耐受能力是截然不同的,只有少数大鼠可以经受住这个病理过程并存活下来,这其中是否有基因方面的差异在起关键作用呢?本实验的目的就是试图通过基因芯片技术筛查出与休克发生发展密切相关的基因并在mRNA及蛋白水平进行初步验证,从中发现并选择出潜在的关键性基因作为进一步研究对象,检测其在休克前后及复苏后不同时段肝脏中表达的差异,分析其可能的作用机制,为进一步的研究做出初步探索。方法第一部分:休克相关背景基因的筛查:建立左肝外叶切除-定容失血性休克大鼠模型,放血前切除大鼠肝脏左外叶留取标本作为背景,严格标化放血前的手术操作过程,按2.5ml/100g的失血比例、2.0ml.Kg-1.min-1的速率放血,将存活组与死亡组大鼠的术前肝脏及存活组大鼠的术后24h肝脏取出行cDNA基因芯片筛查,找出差异基因,通过RT-PCR验证芯片数据的可信性。利用调控网络（KEGG）分析差异基因间的相互联系,利用转录因子结合位点分析,选择目的基因分析其上游的核转录基因,为进一步的检测做准备。第二部分:检测EPHX2、YY1在休克大鼠肝脏中的表达:建立定压失血性休克-复苏大鼠模型,将实验动物随机分为对照组、休克不复苏组（HS）、复苏后1h组（HSR1）、复苏后3h组（HSR3）、复苏后6h组（HSR6）,放血至大鼠平均动脉压（MAP）降至30±5mmHg并在此水平下维持1h,复苏组在休克维持1h后予以1/2自身全血+3/2乳酸林格氏液15分钟内复苏,通过rt-PCR及Western blotting技术检测各组肝脏组织中EPHX2和YY1的基因和蛋白的表达情况。结果第一部分:在同样2.5ml/100g的比例、2.0ml.Kg-1.min-1的速率条件下失血的大鼠定容失血性休克+肝左外叶切除模型中,大鼠的生存率在50%左右,在总共21793个大鼠基因中存活组与死亡组术前相比较有100个差异基因（fold>2）,其中上调基因47个,下调基因53个,这些差异基因的功能分析显示其多与生物节律、β-丙胺酸代谢、组氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、甘氨酸-丝氨酸-组氨酸代谢、维生素B6代谢、精氨酸和苏氨酸代谢相关。Aldh1a7、Aoc3、Cyp26al、HDC和EPHX2基因的RT-PCR检测显示其与芯片检测结果相符。在这些差异基因中,EPHX2基因在存活组的含量低于死亡组,我们将其做为目的基因做进一步的检测。第二部分:在定压失血性休克+复苏的大鼠模型中发现,与对照组相比,在肝脏中,EPHX2在休克维持期1h末（HS组）明显增高（P<0.05）,予以复苏后,随着复苏时间的推移,EPHX2在1h（HSR1组）、3h（HSR3组）、6h（HSR6组）逐渐降低,其中HS组与HSR1组、HSR1组与HSR3组差异明显（P<0.05）,HSR3组与HSR6组差异无明显统计学意义。与之相对应的,核转录因子YY1的变化趋势与EPHX2呈相反的变化,提示其对EPHX2可能起到一个负调控的作用。结论本次实验为休克发生发展的研究提供了一个不同的视角,即从原始背景的角度在基因水平寻找差异。实验证实了不同的大鼠即使在相同的实验条件下其抗休克的能力是显著不同的,这可能与自身基因的差异有关。EPHX2的升高与休克大鼠肝细胞的凋亡有关,核转录因子YY1做为EPHX2的上游基因对其有负相调控作用,对YY1的扩增可能对大鼠的抗休克有保护作用。
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